[发明专利]具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用

说明书

本发明涉及具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用，属于生物来源杀菌剂和农药加工工艺领域，具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，包括制备发光杆菌发酵液、DHIS的分离与纯化、结构鉴定，并提供了发光杆菌发酵液中DHIS含量分析的方法，以及用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病的应用及使用方法。本发明优化了对发光杆菌的发酵条件，大大提高了3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯的产量，本发明制备的DHIS对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于DHIS在空气中不稳定而导致的防效降低。

技术领域

本发明属于生物来源杀菌剂和农药加工工艺，具体是涉及一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用。

背景技术

灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的一种世界性病害。随着温室和大棚中番茄栽培面积的不断扩大，导致灰霉病成为主要病害之一，每年都会造成大量经济损失，一般为20％～40％，严重的达60％。目前，防治灰霉病以化学防治为主，常用的杀菌剂主要有二甲酰亚胺类杀菌剂、苯并咪唑类杀菌剂、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺、啶酰菌胺和咯菌腈等。化学农药虽然取得了一定的防治效果，但其带来的“3R(residue,resistance,resurgence)”问题已经引起社会和国内外有关专家的高度重视，开发高效、低毒、对环境安全的生物农药，已成为农药研发的主要途径之一。

3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(简称DHIS，见图1)，该化合物广泛存在于发光杆菌的发酵液中，它被称为“瑞士军刀”具有很突出的生物活性，例如可抑制热带疾病中的原生生物，可抗真菌和抗革兰氏阳性菌，杀线虫，可抑制溶性环氧化合物水解酶[solubleepoxid hydrolase(sEH)]和在不同的肿瘤细胞系中显示抗增殖活性，可治疗银屑病，可治疗免疫和炎症等疾病，如专利(申请号为： 201710084890.2)报道了该化合物作为杀螨剂及其治疗性应用。目前该化合物的制备路线从酸开始，进行了米迦勒加成、克莱森缩合反应、一锅法、皂化和脱羧等一系列反应，该方法产量低、分离纯化困难。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用，本发明优化了对发光杆菌的发酵条件，大大提高了3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量，本发明制备的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在空气中不稳定而导致的防效降低。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，本发明提供了具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其技术要点是：

(1)制备发光杆菌发酵液

所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10 日；保藏编号为：CCTCCNO：M2018664，分类命名为：Photorhabdus temperata subsp.cinerea SN35。

所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养120h得到发光杆菌发酵液；

所述改良M培养基的配方为：蛋白胨为15-35g/L，氯化钠为1-5g/L，葡萄糖6.13g/L，硫酸镁1.50g/L，硫酸铵2.46g/L，磷酸二氢钾0.86g/L，磷酸氢二钾1.11g/L，硫酸钠1.72g/L，亮氨酸3.00g/L，蒸馏水1L，pH值7.2～7.6；

(2)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的分离与纯化