[发明专利]具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用

权利要求书

1.具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）制备发光杆菌发酵液

所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10日；保藏编号为：CCTCC NO：M2018664，分类命名为：Photorhabdus temperata subsp. cinerea SN35；

所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180 r/min、28 °C的恒温摇床上培养120 h得到发光杆菌发酵液；

所述改良M 培养基的配方为：蛋白胨为15-35 g/L，氯化钠为1-5 g/L，葡萄糖6.13 g/L，硫酸镁 1.50 g/L，硫酸铵 2.46 g/L，磷酸二氢钾0.86 g/L，磷酸氢二钾 1.11 g/L，硫酸钠 1.72 g/L，亮氨酸3.00 g/L，蒸馏水1 L，pH 值7.2~7.6；

（2）DHIS（3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯）的分离与纯化

将步骤（1）中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体，收集上清液，向上清液中加入5%的大孔树脂吸附4 h后将大孔树脂取出放置在30°C 烘箱中充分烘干，烘干后用甲醇浸泡3-4次，将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏，浸膏用甲醇：水 = 1：1的溶液再次溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏；将二氯甲烷浸膏用正相硅胶柱(350 mm × 30 mm i.d.)分离纯化，依次用V (石油醚) ：V (乙酸乙酯) = (100:5、 100:10、100:20、100:30、100:40 和 0:100 ) 梯度洗脱，每个梯度3 L，得到5个组分（A1-A5）；然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶柱层析制备得到；

（3）DHIS（3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯）的结构鉴定

将步骤（2）中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的结构。

2.根据权利要求1所述的具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：所述改良M 培养基配方为：葡萄糖6.13 g/L，蛋白胨33.23 g/L，硫酸镁 1.50 g/L，硫酸铵 2.46g/L，磷酸二氢钾0.86 g/L，磷酸氢二钾 1.11 g/L，硫酸钠 1.72 g/L，亮氨酸3.00 g/L，氯化钠3.01 g/L，蒸馏水1 L，pH 值7.2~7.6。

3.根据权利要求1所述的具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：所述发光杆菌发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量分析的方法，包括以下步骤：

（1）通过向40 mL的改良M培养基中接种等量的种子液培养得到发酵液，再离心、过滤对发酵液进行预处理；

（2）在高效液相色谱分析过程中，色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB，4.60×250 mm，5 μm；流动相：68% 甲醇水+0.1% 甲酸溶液；进样体积：10 µL；流速1.0 mL/min，柱温：30-39℃；检测波长：247 nm；

（3）在步骤（2）的色谱条件下绘制发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量的标准曲线，具体的回归方程如下：Y = 10069X+3.7629 (R² = 0.9974)，其中Y为峰面积，X为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的浓度，单位为g/L。

4.具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的应用，其特征是：所述DHIS（3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯）可以用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病。

5.根据权利要求4所述的具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的应用，其特征是：所述灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病包括黄瓜灰霉病和番茄灰霉病。