[发明专利]靶向新型GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体方法

说明书

本发明涉及靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接MASK编码序列，抗GPC3单链抗体的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、人IgG4铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明制备的CART细胞带有tEGFR组件其具有体内示踪和安全开关的作用。

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体涉及靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原 受体及其用途。

背景技术

肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见 原因中位居第三(Bosch等，Gastroenterologyl 27:S5-Sl6，2004；El– Serag等，Gastroenterologyl32:2557 76，2007)。根据美国癌症学会， 肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75％，往往直到晚期肝癌才会有症状。外科 手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。 因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。

磷脂酰肌醇蛋白多糖3(Glypican 3，GPC3)是一种细胞表面蛋白，属 于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70kDa左右的前体核心蛋 白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40kDa左右的可溶性的 能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS) 糖链的膜结合的竣基端(C末端)肽(Capurro等，DevCe 1114:700 711， 2008；Capurro等，Cancer Res 65:6245-6254，2005)。GPC3高度表 达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表 达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较 高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌， 胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。 此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤 等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表 达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是 指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化 扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经 成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗 必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非 依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿 瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克 隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞 内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞 自身的安全性来讲都是关键的决定因素。