[发明专利]一种免疫增强型多价疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种免疫增强型多价疫苗及其制备方法和应用。本发明的多价疫苗由LAG‑3干扰基因重组表达载体和融合多肽通过静电作用结合，所述LAG‑3干扰基因重组表达载体由LAG‑3 RNAi片段和真核表达载体连接组成。通过融合多肽的合成与纯化、LAG‑3干扰基因重组表达载体的构建及LAG‑3干扰基因重组表达载体与表位肽的连接着这三个步骤制成。本发明的多价疫苗能有效激发特异性CTL应答，刺激T细胞活化，从而产生广泛的免疫激活效应，诱导强有力的抗肿瘤免疫并通过激发CTL产生细胞毒效应，杀伤胶质瘤细胞，且制备方法简单，成本低廉，在胶质瘤治疗领域有着较好的开发应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种免疫增强型多价疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

Endocan是内皮细胞特异分子-1(ESM-1)的抗原表位，是一种可溶性的蛋白聚糖，由一条硫酸皮肤素链和一个核心蛋白相连而成，其基因位于人第五号染色体5q11上，含3个外显子和2个内含子。它的表达受细胞因子、血管生长因子、转录因子等多种因素的复杂调控。随着对Endocan进一步研究,发现Endocan通过促进细胞增殖、免疫抑制、促进肿瘤的侵袭和转移、调节细胞外基质微环境,参与了多种肿瘤的发生、发展,如在颅内胶质瘤、黑色素瘤、脂肪瘤均发现Endocan在不同病理级别胶质瘤中的表达与临床意义。

由于细胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由进入细胞。近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽相继被发现，其可有效携带外源性大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透能力的多肽被命名为细胞穿膜肽(CPP)。研究发现，穿膜肽可有效促进与之偶联的外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原递呈途径，表现为动力学显著增强，且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

内质网(ER)是MHC-I类分子递呈抗原肽的最重要场所，若使外源性抗原肽靶向转运至ER腔，可望增强外源性抗原肽被MHC-I类分子提呈的效率。研究发现，ER滞留信号—赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸基序可明显增强与之偶联的外源CTL表位在APC内的MHC-I类抗原递呈效率，并且显著延长APC表面MHC-肽复合物的递呈时间，提示羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-I类抗原递呈途径的一个简单有效的新策略。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)是一种重要的免疫检查点，在调节T细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用，LAG-3主要表达于活化后的效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞及浆细胞样树突状细胞。越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，LAG-3都会负调控效应T细胞的功能(活化、细胞因子释放和细胞杀伤)，同时会增强调节性T细胞的免疫抑制功能。LAG-3还是T细胞耗竭的一个标志，在肿瘤和慢性感染环境中，LAG-3的表达会在T细胞表面明显上调，通过单克隆抗体阻断LAG-3，会增强T细胞的增殖和细胞因子释放，而且会延迟细胞周期停滞，增加记忆T细胞亚型的比例。

胶质瘤是中枢神经系统常见的颅内原发肿瘤，国内资料统计平均为40-50％。现已明确化疗能延长一些胶质瘤患者的生存期，但效果仍不理想。随着分子生物科学技术的迅速发展，肿瘤的分子水平及浸润、转移、生长增殖、血管发生等一些分子参与的发病机制的认识越来越多，肿瘤的分子治疗逐渐显示了日益重要的地位。

肿瘤特异性免疫治疗由于不伤及无关正常组织，是近年来发展迅速的肿瘤治疗方法。其基本原理是肿瘤抗原多肽在抗原提呈细胞(APC)的作用下以MHC-I-肽复合物(与MHC-I类分子结合的肽被定义为CTL表位)的形式被提呈于APC表面，CTL通过其T细胞受体特异识别APC表面的MHC-I-肽复合物而得以活化，最终特异识别存在于肿瘤细胞表面的抗原多肽而特异杀伤肿瘤细胞。

因此，为了达到上述目的，寻求一种能够诱导强的抗肿瘤免疫且抗胶质瘤效果更好、制备方法更简便的靶向杀伤肿瘤细胞，尤其是胶质瘤细胞的疫苗显得很有必要。

发明内容