[发明专利]一种核酸提取扩增检测试剂盒

说明书

本发明提出一种核酸提取扩增检测试剂盒，该核酸提取扩增检测试剂盒由裂解液试剂盒以及PCR管组成。裂解液试剂盒内盛放核酸裂解液，待测样本加入核酸裂解液之后，通过所述核酸裂解液的作用使病毒核酸释放出来，并实现纯化，样本加入核酸裂解液之后所得物可以直接加入到PCR管实现PCR检测。所述PCR管内放置直接用于荧光定量PCR测量的冷冻干粉PCR扩增体系试剂，所述冷冻干粉PCR扩增体系试剂是以PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、反应特异性引物、探针以及冻干保护剂为原料通过冷冻干燥工艺制备的所得物。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种核酸提取扩增检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

实时荧光定量PCR技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于PCR扩增。核酸提取是核酸检测第一步，也是分子生物学中关键方法之一。为下游核酸检测提供基础，提取质量和完整性直接影响临床研究或诊断。

一般核酸提取过程包括两步：样品的裂解和纯化。传统的提取试剂由于取得率相对较低，且步骤较为繁杂，给提取工作带来一定影响，难以得到合格核酸样品。磁珠法是近几年发展起来的核酸提取方式，提取的核酸纯度高、产量大。显然，传统方法操作步骤多、成本高、对样品的需要量较大且易于造成交叉污染，不利于客户快速提取纯化核酸样本。

另外，在目前核酸检测应用最广的实时荧光PCR技术中，试剂大都不是即用型的，造成PCR检测普遍存在操作复杂、费事、所需费用高等问题，使用前需要有复杂的配置工作，容易造成试验的误差甚至失败。不同人员操作也引起实验误差；某些试剂在常温下保存不稳定；不能做到一步法快速提取核酸；PCR检测试剂需要现场手动配置，多个步骤需要人工标记，各阶段的检测仪器独立，不利于全自动处理大量试验样本。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的以上缺陷，本发明提出了一种核酸提取扩增检测试剂盒及其检测方法。该核酸提取扩增检测试剂盒及其检测方法采用了直接提取并扩增反应检测临床样本中病毒核酸的实时荧光PCR反应体系，将待测样本加入裂解液实现核酸裂解与纯化，裂解纯化后的产物可以直接进行PCR检测，并以即用型的冻干粉试剂实现扩增反应与PCR检测，无需测前配制，检测彻底解决了依赖于纯化的核酸DNA为模板进行PCR扩增这一瓶颈问题，适用样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液和粘液等多类型样本。

本发明提供一种核酸提取扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：裂解液试剂盒以及PCR管，裂解液试剂盒内盛放核酸裂解液，通过所述核酸裂解液的作用使病毒核酸释放出来；所述PCR管内放置直接用于荧光定量PCR测量的冷冻干粉PCR扩增体系试剂，所述冷冻干粉PCR扩增体系试剂是以PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、反应特异性引物、探针以及冻干保护剂为原料通过冷冻干燥工艺制备的所得物。

其中，所述核酸裂解液包括GuHCl、NaOH、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、NaCl、聚乙二醇辛基苯基醚、表面活性剂、苯酚、异戊醇。其中，GuHCl的浓度为5.6-5.85g/10ML；乙二胺四乙酸0.03-0.04g/10ML；三羟甲基氨基甲烷0.06-0.07g/10ML；NaCl 0.01-0.015g/10ML；聚乙二醇辛基苯基醚2％-10％(体积比例)；表面活性剂0.075-0.1％(体积比)；核酸裂解液中加入1％-2.5％(体积比例)的苯酚、异戊醇混合液，其中苯酚、异戊醇体积比20:1-25:1。

所述表面活性剂采用以下任意一种：十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠。

其中，所述冷冻干粉PCR扩增体系试剂采用如下方式制备：将PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、反应特异性引物、探针与冻干保护剂溶液按照预定比例混合后，冷冻干燥。