[发明专利]针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系

说明书

本发明公开了一种针对HBB‑28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB‑28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。所述CRISPR单碱基供体修复体系包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。本发明的修复体系能用于HBB‑28地中海贫血的治疗。

技术领域

本发明涉及CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicRepeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因治疗领域，本发明公开了针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。

背景技术

β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成a与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。β地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白转录启示区的TATA盒-28点突变(A→G)是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一。

据报道，全世界约有4亿地中海贫血症基因携带者。在我国，该疾病好发于南方地区，尤其是广东省境内发生率远远高于其他省份。2012年对广东省21个地市共14332个户籍住院分娩孕妇的筛查研究发现，地贫基因携带率为16.8％，即高达1/6育龄人群携带地贫基因。每例重症地贫患儿的出生给社会和家庭带来的经济负担高达100万到300万元。目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地贫致病基因的传播。随着基因编辑技术的出现与发展，如何利用基因编辑技术对基因突变类型遗传性疾病进行预防与治疗是目前新兴的疾病临床治疗模式。

从2011年美国率先提出“迈向精准医学”的倡议后，中国的精准医学也不断向前推进。“精确的基因编辑”是基因编辑技术的核心，也是精准医学的重要体现。开展基于特异性基因突变所致疾病的基因编辑精准治疗，获得更加精准高效的基因编辑是未来疾病治疗的创新方向。CRISPR技术自2012年面世以来，极大地促进了基因编辑在多种疾病包括恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗作用，获得了广泛的临床应用，诸如此类：2016年美国国立卫生研究所批准了从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞输回病人体内，基因修饰后的T细胞将靶向摧毁肿瘤细胞；2018年5月，NATURE杂志报道了通过CAR-T治疗治愈一例患者白血病的病例；在中国，2016年10月首次批准了利用CRISPR开展人体临床试验，来治疗化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者等等。

已有报道利用CRISPR治疗地中海贫血：通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者体细胞β珠蛋白基因(hemoglobin subunit beta，HBB)缺陷基因，然后将基因编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。