[发明专利]一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法和引物

说明书

本发明提供一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法和引物，属于分子生物学技术领域，检测自噬水平选用的基因包括LC3和BECN1；LC3扩增引物如SEQ ID NO:1、2、3和4所示。荧光定量检测方法为实时荧光定量PCR方法，具体包括如下步骤：提取曼氏无针乌贼基因组总RNA，反转录合成cDNA；利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR，检测。本发明引物能够反映细胞的自噬活性，可以简便、定量地检测细胞内自噬水平，进而来监测环境及胁迫因子对曼氏无针乌贼自噬水平的调节影响；本发明检测方法能保证LC3和BECN1的表达量，能真实反映细胞的自噬活性，灵敏度和准确性高。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法和引物。

背景技术

头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。乌贼属于软体动物门(Mollusca)、头足纲 (Cephalopoda)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。由于过度捕捞与环境变化，我国东海的曼氏无针乌贼资源量一度遭到极大破坏，其自然群体明显衰退，产量急剧下降，临近濒危。自上个世纪80年代以来，得益于人工繁育和养成技术的突破，其资源量正处于逐步恢复中。

自噬(Autophagy)是正常的真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。当机体在发育分化、组织重建过程中，或受环境胁迫(温度、pH、紫外照射、毒性刺激等)、细胞内压力(饥饿、病毒或细菌侵染)以及激素刺激时，都会激活自噬信号通路。细胞在正常情况下保持了较低水平的、基础的自噬活性以维持自身稳态，被视为是更“灵活、快速、高效”的细胞内降解途径。细胞自噬在细胞废物清除、结构重建、生长发育中起重要作用，而自噬功能紊乱则会导致肿瘤发生、神经退行性疾病和微生物感染等问题。因此，自噬发生和调控机制的相关探索也成为当前生命科学研究领域的热点之一。目前已有的检测黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平的方法包括实时荧光定量PCR、RNA测序、基因芯片、荧光原位杂交等技术，最常用的方法是实时荧光定量PCR。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种能够反映细胞的自噬活性，可以简便、定量地检测细胞内自噬水平，进而来监测环境及胁迫因子对曼氏无针乌贼自噬水平的调节影响的曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法用引物。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法用引物，

检测自噬水平选用的基因包括LC3和BECN1；

其中LC3扩增引物为：5’-CGCCGTTTACAGTTGCATCC-3’； 5’-GCCGTCGTCATCTTTTTCCC-3’；

BECN1扩增引物：5’-ATGCACAAAGCCAACTGGAAA-3’； 5’-TGACCCCAAGCAGCATTGAT-3’。本发明首次公开了一种适用于曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法的引物序列，选用LC3和BECN1作为自噬水平的标志物，能够反映细胞的自噬活性，可以简便、定量地检测细胞内自噬水平，进而来监测环境及胁迫因子对曼氏无针乌贼自噬水平的调节影响，填补了包括头足类在内的海洋生物自噬领域的技术空白，同时为检测环境及胁迫因子引起的头足类自噬水平变化提供有效方法。