[发明专利]一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法和引物有效
| 申请号： | 201811236678.4 | 申请日： | 2018-10-23 |
| 公开（公告）号： | CN109402267B | 公开（公告）日： | 2022-03-18 |
| 发明（设计）人： | 柳意樊 | 申请（专利权）人： | 浙江海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 杭州浙科专利事务所(普通合伙) 33213 | 代理人： | 吴秉中 |
| 地址： | 316000 浙江省舟山市普陀海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 曼氏无针 乌贼 水平 荧光 定量 检测 方法 引物 | ||
1.一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法，其特征在于：所述荧光定量检测方法为实时荧光定量PCR方法，具体包括如下步骤：
1)提取曼氏无针乌贼基因组总RNA，反转录合成cDNA；
2)利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR检测；
检测自噬水平的基因包括LC3和BECN1；所用引物包括LC3扩增用引物和BECN1扩增用引物；
所述LC3扩增用引物为：5’-CGCCGTTTACAGTTGCATCC-3’；5’-GCCGTCGTCATCTTTTTCCC-3’；
所述BECN1扩增用引物为：5’-ATGCACAAAGCCAACTGGAAA-3’；5’-TGACCCCAAGCAGCATTGAT-3’；
LC3扩增片段大小为117bp，扩增序列为：CGCCGTTTACAGTTGCATCCCAGCCAAGCTTTTTATCTTCTGGTGAATGACAGAAGCATGATCAGCAACACAACACCAATATCTGAGGTATATGAGCGGGAAAAAGATGACGACGGC；
BECN1扩增片段大小为160bp，扩增序列为：ATGCACAAAGCCAACTGGAAAAATTGACCAAAACCAATGTCTTTAATGCTACATTCCATATATGGCACAATGGCCATTTTGTGACCATCAATAACTTTCGACTTGGACGTCTACCAAATGCACAGGTGGAGTGGAATGAAATCAATGCTGCTTGGGGTCA。
2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR扩增采用SYBR Green染料法。
3.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL：7.6μL ddH2O、0.4μL 20μM Forward Primer、0.4μL 20μM Reverse Primer、10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6μL cDNA模板。
4.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法，其特征在于：RNA提取时加入氯喹。
5.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR扩增反应程序选择两步法：
6.权利要求 1-5任一项所述的一种曼氏无针乌贼自噬水平的荧光定量检测方法的用途，其特征在于：所述检测方法在环境检测中的用途；所述曼氏无针乌贼作为检测环境污染的生物样本；所述LC3和BECN1基因用作环境污染的检测标记物。
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