[发明专利]一种耐受高浓度葡萄糖的L-丙氨酸生产菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种发酵生产L‑丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将生产L‑丙氨酸的大肠杆菌作为出发菌株，在高浓度葡萄糖培养基中进行适应性进化，获得了高浓度葡萄糖下发酵生产L‑丙氨酸的新型菌种FMME‑A232，使得在生产L‑丙氨酸的过程中能够耐受浓度高达180～220g/L的葡糖糖，相对于申请号201810033877.9中生产L‑丙氨酸的过程中只能够耐受浓度为80～100g/L的葡糖糖，其高浓度葡萄糖耐受能力得到了大大提高，使得发酵过程中无需多次添加葡糖糖，而一次添加即可，简化了发酵工艺，且利用该重组菌株在发酵罐中发酵55h，L‑丙氨酸产量可达到171.0g/L。

技术领域

本发明涉及一种耐受高浓度葡萄糖的L-丙氨酸生产菌株及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是最小的手性分子之一，在医药、食品、日化等领域用途广泛。在医药领域，L-丙氨酸常被添加到输液中，也是合成维生素B6和氨基丙醇的主要原料；在食品领域，L-丙氨酸可以作为天然甜味剂对改善调味剂的味感和有机酸的酸。

L-丙氨酸的生产工艺主要包括酶催化法和发酵法。酶催化法是通过培养富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD(EC4.1.1.12)活力的微生物细胞，催化L-天冬氨酸得到L-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备要求简易，提取工艺简单，但主要原材料L-天冬氨酸的价格高，其生产原料为富马酸，富马酸是经石油炼制生产的，石油资源属于不可再生资源。发酵法通常是通过代谢工程和合成生物学手段改造遗传背景清晰的大肠杆菌，实现L-丙氨酸的高产。本课题组通过对大肠杆菌K12进行代谢工程改造，同时通过两阶段控制进行补料发酵，实现发酵42h，L-丙氨酸产量达到153.9g/L(专利号：201810033877.9)，达到了工业化水平。发酵法生产L-丙氨酸是以葡萄糖为碳源，葡萄糖为可持续再生生物质资源，生产成本降低。

发酵法生产通常采用两阶段发酵，前期好氧发酵可以有利于菌体积累，后期厌氧发酵游离与产物L-丙氨酸积累，同时需要发酵过程中需多次补加葡萄糖，发酵工艺相对复杂，而培养基中添加高浓度葡萄糖会影响菌体生长与产品积累。

发明内容

本发明以高产L-丙氨酸的大肠杆菌E.coliΔ5D2(专利号：201810033877.9)为出发菌株，通过连续培养不断提高葡萄糖浓度进行适应性进化，获得耐受高浓度葡萄糖的大肠杆菌，在发酵培养基中一次性添加高浓度葡萄糖，无需补料，简化了发酵工艺。

本发明的第一个目的在于提供一株在高浓度葡萄糖条件下高产L-丙氨酸的大肠杆菌FMME-A232，所述大肠杆菌FMME-A232已于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018628，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌FMME-A232在食品和/或药品中的应用

可选的，所述应用是使用大肠杆菌FMME-A232生产L-丙氨酸。

本发明的第三个目的在于提供一种发酵生产L-丙氨酸的方法，所述方法是利用所述大肠杆菌FMME-A232发酵生产L-丙氨酸。

可选的，所述利用所述大肠杆菌FMME-A232发酵生产L-丙氨酸，包括：将FMME-A232菌株接种于种子培养基，33～37℃震荡培养12～16h，按照5～15％接种量接种于发酵培养基，前期好氧发酵，温度28～32℃，空气量1.0～1.5vvm，搅拌300～400rpm培养18～30h，后期限氧阶段将通气量降低至0.01～0.1vvm，温度上升至40～45℃，继续搅拌50～100rpm，当葡萄糖消耗尽后立即结束发酵。

可选的，所述种子培养基成分包括：葡萄糖15～25g/L，酵母粉3～6g/L，大豆蛋白胨2～6h/L，NaCl 5～10g/L。