[发明专利]一种三七不定根的诱导方法

权利要求书

1.一种三七不定根的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤:

S1、组合培养基的配制：

S11、滤纸片剪裁：取定性滤纸将其裁剪成与无菌组培瓶底部形状一致的圆形，灭菌备用；

S12、MS培养基的配制：取MS固体粉末溶于水，添加蔗糖和琼脂，调节pH＝5.8～6.0，121℃、0.1MPa高温灭菌25min后保温防止凝固，配制成蔗糖浓度为30～50g/L，琼脂含量为8g/L的MS固琼脂养基；

S13、上层愈伤组织诱导滤纸的制备：取0.5～1.0mg/L 2,4-D除菌，将4片步骤S11所得滤纸片叠放在一起，在2,4-D中浸泡20s，得上层愈伤组织诱导滤纸层；

S14、中层不定根诱导滤纸层的制备：取植物激素除菌后混匀，得混合植物激素1，所述混合植物激素1中含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA；将4片步骤S11所得滤纸片叠放在一起，置于所述混合植物激素1中浸泡20s，得中层不定根诱导滤纸层；

S15、底层不定根诱导滤纸层的制备：取植物激素除菌后混匀，得混合植物激素2，所述混合植物激素2中含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT和50μmol/L茉莉酸甲酯；将4片步骤S11所得滤纸片叠放在一起，在混合植物激素2中浸泡20s，得底层不定根诱导滤纸层；

S16、组合培养基的制备：将步骤S15所得底层不定根诱导滤纸层平铺于无菌组培瓶底，倒入步骤S12制备的MS琼脂培养基，凝固后形成厚度为1.0cm的底层MS层；将步骤S14所得中层不定根诱导滤纸层平铺于底层MS层上，倒入步骤S12制备的MS琼脂培养基，凝固后形成厚度为0.5cm的中层MS；将步骤S13制备的上层愈伤组织诱导滤纸层平铺于中层MS上，得组合培养基；所述组合培养基从下至上依次为底层不定根诱导滤纸层、底层MS层、中层不定根诱导滤纸层、中层MS层、上层愈伤组织诱导滤纸层；

S2、三七愈伤组织的诱导：取无菌三七根、幼嫩茎段2cm左右或幼嫩叶片置于步骤S1制备的组合培养基的上层愈伤组织诱导滤纸层上，24～28℃下黑暗无菌培养10～15d，获得三七愈伤组织；

S3、三七不定根的诱导：向步骤S1制备的组合培养基中加入无菌MS液体培养基，液体没过培养基上层滤纸层1mm，在24～28℃及黑暗条件下无菌培养15～20d，得到带有愈伤组织的三七不定根。

2.一种用于权利要求1所述三七不定根诱导的组合培养基，其特征在于，所述培养基由下至上依次为底层不定根诱导滤纸层、底层MS层、中层不定根诱导滤纸层、中层MS层和上层愈伤组织诱导滤纸层；

其中，底层不定根诱导滤纸层由4片含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT、50μmol/L茉莉酸甲酯的滤纸叠放而成；中层不定根诱导滤纸层由4片含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA的滤纸叠放而成；上层愈伤组织诱导滤纸层由4片含有0.5～1.0mg/L 2,4-D的滤纸叠放而成；底层MS层为厚度1.0cm的蔗糖的浓度为30～50g/L，琼脂含量为8g/L的MS固体琼脂养基；中层MS层为厚度0.5cm的蔗糖的浓度为30～50g/L、琼脂含量为8g/L的MS固体琼脂养基。

3.根据权利要求2所述用于三七不定根诱导的组合培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、滤纸片剪裁：取定性滤纸将其裁剪成与无菌组培瓶底部大小一致的圆形纸片，灭菌备用；

S2、取MS固体粉末溶于水，添加蔗糖和琼脂，调节pH＝5.8～6.0，121℃、0.1MPa高温灭菌25min后保温防止凝固，配制成蔗糖的浓度为30～50g/L、琼脂含量为8g/L的MS固体琼脂养基；

S3、上层愈伤组织诱导滤纸的制备：取0.5～1.0mg/L 2,4-D除菌，将4片步骤S11所得灭菌后的滤纸片叠放在一起，在2,4-D中浸泡20s，得上层愈伤组织诱导滤纸层；

S4、中层不定根诱导滤纸层的制备：取植物激素除菌后混匀，得混合植物激素1，所述混合植物激素1中含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA，将4片步骤S1所得灭菌后的滤纸片叠放在一起，置于所述混合植物激素1中浸泡20s，得中层不定根诱导滤纸层；

S5、底层不定根诱导滤纸层的制备：取植物激素除菌后混匀，得混合植物激素2，所述混合植物激素2中含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT和50μmol/L茉莉酸甲酯，将4片步骤S1所得灭菌后的滤纸片叠放在一起，在混合植物激素2中浸泡20s，得底层不定根诱导滤纸层；

S6、组合培养基的制备：将步骤S5所得底层不定根诱导滤纸层平铺于无菌组培瓶底，倒入步骤S2制备的MS琼脂培养基，凝固后形成厚度为1.0cm的底层MS层；将步骤S4所得中层不定根诱导滤纸层平铺于底层MS层上，倒入步骤S2制备的MS琼脂培养基，凝固后形成厚度为0.5cm的中层MS；将步骤S3制备的上层愈伤组织诱导滤纸层平铺于中层MS上，得组合培养基；所述组合培养基从下至上依次为底层不定根诱导滤纸层、底层MS层、中层不定根诱导滤纸层、中层MS层、上层愈伤组织诱导滤纸层。