[发明专利]重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2及制备方法

说明书

本发明公开一种重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK‑M2及其制备方法，本发明从改造重组布氏白僵菌的蛋白酶K分子结构入手，得到活性和稳定性均提高的蛋白酶K突变体PK‑M2，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；优化表达系统，利用酵母细胞外分泌表达技术，可大规模发酵高效表达重组蛋白酶K突变体，进一步提高蛋白酶K产量；采用高效亲和层析的蛋白纯化方式，提高蛋白酶K纯化过程中的收率，实现了蛋白酶K的规模化生产。

技术领域

本发明涉及基因改造和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种酶活力高、稳定性好、操作简便、适用于大规模生产的重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2及制备方法。

背景技术

蛋白酶K（Proteinase K, EC 3.4.21.64）是一种重要的丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）的提取物中发现。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键。

蛋白酶K在生化实验中应用较为广泛：在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交中，具有降解包围靶DNA蛋白质的作用，可用来处理杂交前的样本，提高检测的灵敏性；在生物检测方面，可以用来检测脑组织中的致病性朊病毒。除此之外，蛋白酶K在污水处理、工业制造、造纸、生物加工过程及饲料等领域展现出良好的应用效果。

目前，生产蛋白酶K主要有两条途径：一是由林伯氏白色念球菌经发酵后分离纯化获得，二是通过基因重组表达后获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，故蛋白酶K的产量较低；而且林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度，使其生产成本较高，不适合大规模生产。2008年，来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K成功在毕赤酵母系统中实现了分泌表达；之后来源于布氏白僵菌的蛋白酶K也成功在毕赤酵母系统中实现了分泌表达，并且重组布氏白僵菌蛋白酶K活性较野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K高出50％。但在实际运用中发现，重组布氏白僵菌蛋白酶K溶液在4℃保存时酶活稳定性较差，酶活降低很快，大规模产业化应用受到限制。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种酶活力高、稳定性好、操作简便、适用于大规模生产的重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 构建重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体 pPIC9K-M2

合成如SEQ ID NO.2所示的M2编码序列并克隆至pUC57质粒中，得到pUC57/M2质粒；扩增pUC57/M2质粒，分别用限制性内切酶EcoR I、Not I将M2编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体连接，将连接产物转化至TOP 10感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，得到重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体载体 pPIC9K-M2；

b. 将重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体pPIC9K-M2转化到GS115酵母感受态细胞

利用限制性内切酶Sal I酶切重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体载体 pPIC9K-M2，再用TE缓冲液溶解至浓度为2μg/μL的线性片段，取10μL线性片段与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min后电击；之后向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后转至1.5mL EP管中，30℃静置孵育5h；将菌体悬液每200μL涂布一块MD平板上，将MD平板置于30℃环境培养至出现单个菌落；