[发明专利]重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2及制备方法

权利要求书

1.一种重组布氏白僵菌蛋白酶(Beaveria brongniartii)K突变体PK-M2，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 构建重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体 pPIC9K-M2

合成如SEQ ID NO.2所示的M2编码序列并克隆至pUC57质粒中，得到pUC57/M2质粒；扩增pUC57/M2质粒，分别用限制性内切酶EcoR I、Not I将M2编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体连接，将连接产物转化至TOP 10感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，得到重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体 pPIC9K-M2；

b. 将重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体pPIC9K-M2转化到GS115酵母感受态细胞

利用限制性内切酶Sal I酶切重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体 pPIC9K-M2，再用TE缓冲液溶解至浓度为2μg/μL的线性片段，取10μL线性片段与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min后电击；之后向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后转至1.5mL EP管中，30℃静置孵育5h；将菌体悬液每200μL涂布一块MD平板上，将MD平板置于30℃环境培养至出现单个菌落；

c. 筛选高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-M2酵母单菌落

配制浓度5g/L G418的YPD筛选平板，在MD平板上挑取200个长出的菌落，点在所述浓度5g/L G418的YPD筛选平板中，再筛选出直径大于2mm的酵母菌落，并以所筛选出的酵母菌落DNA为模板DNA进行PCR鉴定；

所述PCR引物如下：

F-AOX1：gactggttccaattgacaagc；

R-AOX1：ggcaaatggcattctgacat；

所述PCR体系如下表：

反应体系	体积（μL）
2×Taq Mix	10
F-AOX1	0.4
R-AOX1	0.4
模板DNA	0.4
2O]]>	8.8

所述PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2min，反应进行30个循环；72℃延伸5min；

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，筛选PCR产物为 2200bp、1632bp两条条带的酵母单菌落为高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-M2；

d. 将筛选得到的高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-M2的酵母单菌落接种至50mLYPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养OD₆₀₀为3.0时，再按1%的接种量接种至50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为2~6；1500g离心收集菌体，用100mL BMMY培养基重悬菌体，28℃，200rpm继续振荡培养120小时，每24h向发酵液中补加终浓度v/v为0.5%的甲醇；离心培养基，得到含有重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2的发酵液上清；

e. 将发酵液上清经过8,000rpm离心分离、金属离子螯合亲和层析，用含300 mmol/L咪唑、pH 7.5的洗脱缓冲液洗脱，将收集的洗脱液通过超滤去除咪唑、离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色和冻干后得到重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M2。