[发明专利]呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

说明书

本发明公开了一种呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，所述的试剂盒包括扩增芯片和对照试剂，所述的扩增芯片由预分装并冻干在微流控芯片孔内的检测试剂构成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；所述的检测试剂包括成分为RT‑PCR反应液，成分为Buffer、2.0mM dNTPs、1U/μL Taq DNA聚合酶，2U/μL M‑MLV反转录酶，0.3U/μLRRI和9种呼吸道病原体16个型别检测引物探针。试剂盒采用试剂冻干预分装方法将9种呼吸道病原体的16个型别检测引物探针混合液预分装于16孔道微流体扩增管中，结合快速微流控实时荧光PCR扩增仪进行扩增检测，可一次性筛查与呼吸道发热症状相关的9种传染病16个型别。

技术领域

本发明公开一种呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，属于生物技术应用领域。

背景技术

呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占据主要地位,每年的流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。造成呼吸道感染的主要由各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。病毒中常见的是甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、呼吸道腺病毒、鼻病毒等。这些呼吸道病毒大都具有很强的感染力而且传播快、潜伏期短、发病急。并且有越来越多的新的致病性呼吸道病毒被发现，给口岸检验检疫机构预防和控制造成极大的困难。而且由于近些年，呼吸道病毒所引发的疫情不断发生，一些呼吸道病毒如甲型流感病毒、呼吸道腺病毒以及不断变异的新型病毒所导致爆发的疫情成为公共卫生领域面临的一个重要的问题,带来了很大的经济损失及社会危害。

对呼吸道病毒的实验室检测还很大程度依赖传统分离培养和生化鉴定，敏感性低、费时费力，需要一周左右才能完成，难以达到暴发流行时快速检测的要求，而且有的病原体目前还没有合适的细胞体系和动物模型进行培养。当然，也有一些免疫学方法也被广泛的应用到呼吸道病毒的检测,但其敏感性低，假阴性率高，容易造成漏检，难以达到快速检测的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，来解决现有技术中呼吸道发热病原体检测灵敏度低、检测周期长、检测通量低的问题。

为了实现上述目的，发明的技术方案如下：本发明公开了一种呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒，包括扩增芯片和对照试剂，所述的扩增芯片由预分装并冻干在微流控芯片孔内的检测试剂构成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

所述的检测试剂包括成分为RT-PCR反应液，成分为Buffer、2.0mM dNTPs、1U/μLTaq DNA聚合酶，2U/μL M-MLV反转录酶，0.3U/μLRRI和9种呼吸道病原体16个型别检测引物探针。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、快速便捷、无污染，试剂盒采用试剂预分装技术，将每种病原体检测的PCR反应MIX预分装于微流体反应孔中，扩增时仅需加入核酸模板，扩增结束后根据相应孔内有无荧光信号判断是否有相应病原体感染。

2、准确性好、灵敏度高，采用taqman探针法荧光定量PCR检测，所有致病菌均根据其特异性基因设计引物探针，保证检测结果的可靠性；化学热启动DNA聚合酶具有低温抑制，耐高温扩增能力，检测灵敏度高，最低检测限为10³Copies/mL。

3、通量大，一次扩增可筛选9种呼吸道病原体的16个型别，检测通量大。

4、快速，采用快速cDNA合成的反转录酶和快速聚合延伸的Taq DNA聚合酶，配套微流体快速实时荧光PCR仪器可在30min内实现病原体扩增检测副流感病毒(HPIV 1/2/3/4)、冠状病毒(NL63/OC43/229E/HKU1/MERS-CoV)、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒和鼻病毒。