[发明专利]一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸

说明书

本发明公开一种肝片吸虫假定蛋白基因，同时还提供了利用肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，利用肝片吸虫假定蛋白制成肝片吸虫感染检测胶体金试纸条，具有简便、易操作、具有高灵敏性、高特异性、时间短等特点，结果清晰可见，适用于临床现场检测和大规模的流行病学调查。

技术领域

本发明公开一种肝片吸虫假定蛋白基因，同时还提供了利用肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，用于牛羊肝片吸虫感染的血清检测，属于免疫学技术领域。

背景技术

肝片吸虫寄生在牛、羊等反刍动物的肝脏和胆管内，引起宿主急性或慢性的肝炎和胆管炎的人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布，常呈地方性流行，多雨年份能促进本病的流行严重威胁人畜的健康，并对畜牧业的发展造成阻碍。肝片吸虫病的检测常规方法是检查粪便中是否含有肝片吸虫幼虫来确诊，在实践应用中有诸多不方便之处，目前，缺乏简便、快速的肝片吸虫病免疫诊断方法。

发明内容

本发明提供一种肝片吸虫假定蛋白基因（Hypothetical protein D915_11650基因），是利用羊肝片吸虫阳性血清对肝片吸虫 cDNA 文库进行筛选得到的，大小为1005bp，在核苷酸同源性分析中未发现与其同源的基因，是一个新基因。

本发明进一步提供了肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金免疫层析试纸，具有快速便捷、操作简单、不需要特殊仪器等特点，适合临床现场检测及大规模流行病学调查。

本发明所说的一种肝片吸虫假定蛋白基因（Hypothetical protein D915_11650基因），其特征在于：

基因序列如SEQ No.1所示。

用于扩增肝片吸虫假定蛋白基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：

F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’

R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’。

本发明所述的一种肝片吸虫假定蛋白基因制备方法，包括以下步骤：

1）λ噬菌体插入基因的克隆

插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：

F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；

R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3' ；

2）开放性阅读框 PCR 扩增

根据开放性阅读框基因序列，用 Primer5.0 软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、Hind Ⅲ：

F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；

R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；

以肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR扩增

3）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因克隆载体构建

将目的片段与 pMD-18T 载体连接， 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；

4）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650表达载体构建

目的基因基因与 pET-28a 质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。