[发明专利]一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法

说明书

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，该方法是由愈伤组织及不定芽的诱导，不定芽增殖，生根培养以及炼苗和移栽步骤完成，通过本发明提供的方法，愈伤组织诱导率为100%，不定芽的最高诱导率为30%，生根和幼苗成活率分别可达85%和90%。本发明所述方法为新疆野苹果的种质保存和遗传转化研究提供基础。本发明所述方法适用于多种环境，尤其是新疆，甘肃等空气湿度低的地方，大大提高了组培植物的存活率，省时省力。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法。

背景技术

新疆野苹果(Malus sieversii)又名塞威士苹果，属苹果属，是世界栽培苹果的祖先(Velasco et al.2010；Duan et al.2017)。新疆野苹果属第三纪孑遗物种，其果实形态、着色、风味、株型高矮、树形等变异很多。因其自交不亲和特性和自然选择作用形成了许多抗寒抗病虫、耐贫瘠的特异单株，丰富的变异使野苹果赢得了广泛的关注，已经成为西北地区及其他省份的主要砧木之一。位于新疆伊犁谷地的以野苹果为主要建群种的天山野果林是我国重要的自然林，在调节气候、涵养水源、保持水土等方面有着重要的生态作用。但由于农田开发、过度放牧、人为砍伐、苹果小吉丁虫、腐烂病等原因，使得近年来新疆野苹果群落面积急剧减少，新疆野苹果已被列为国家濒危二级保护植物，有效保护这一宝贵种质迫在眉睫。

植物组织培养广义上又称为植物克隆，是以植物细胞全能型为理论基础建立的一种离体培养技术。因其不受地理环境和季节的限制，广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良、基因工程育种等方面。苹果是一类重要的经济作物，一直以来对其组织培养体系研究较多，建立了以子叶、原生质体、茎段等组织器官为外植体的组织培养体系(韩小姣等，2008；潘增光等，2000；王贵章等，2006)，并且建立了栽培苹果主要品种或重要砧木的组培体系(Montecelli，2010；Seong and Song，2008；Szankowski，2003；王淑华等，2016；一种苹果砧木M9的组培快速育苗方法，专利号：CN104737920B；)。然而对栽培苹果的祖先种，新疆野苹果，其组培体系研究较少。李心悦(2018)、刘兵(2011)、谭冬梅(2009)等以茎段为外植体，建立了新疆野苹果的组培体系，但转化效率较低；而以健康叶片为外置体进行组培研究的仅见吴瑞刚等(2017)以新疆野苹果31的叶片为外植体直接诱导了不定芽，但该材料是筛选出的“高再生材料”(李白沙，2014)，叶片可经过诱导直接产生不定芽；而新疆野苹果离体再生频率高低很大程度上依赖于试材基因型，大多数野苹果种质不能直接诱导产生不定芽，因此，需要找寻一种更为普适的、优化的基于叶片愈伤组织分化得到不定芽的方法。本发明以植物幼嫩叶片为外植体，通过愈伤组织诱导及不定芽的再生、芽增殖、生根、壮苗和移栽过程，首次建立了完整基于愈伤组织分化的新疆野苹果的再生体系，最短成苗时间为2.5个月。

新疆野苹果高效再生体系的建立是研究其遗传转化体系的基础，是进行基因功能验证、分子育种的重要技术平台。本发明建立了一整套完善的基于健康叶片愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系，且再生率较高，成苗效率高，为后续新疆野苹果遗传转化体系的建立奠定坚实基础。本发明对新疆野苹果的保育及基因资源开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于，提供了一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，该方法是由愈伤组织及不定芽的诱导，不定芽增殖，生根培养以及炼苗和移栽步骤完成，通过本发明提供的方法，愈伤组织诱导率为100％，不定芽的最高诱导率为30％，生根和幼苗成活率分别可达85％和90％。本发明所述方法为新疆野苹果的种质保存和遗传转化研究提供基础。本发明所述方法适用于多种环境，尤其是新疆，甘肃等空气湿度低的地方，大大提高了组培植物的存活率，省时省力。

本发明所述的一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，该方法以叶片为外植体，愈伤组织诱导及不定芽的诱导，不定芽的增殖，生根培养以及炼苗和移栽，具体操作按下列步骤进行：