[发明专利]一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法

权利要求书

1.一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，其特征在于：该方法以叶片为外植体，愈伤组织诱导及不定芽的诱导，不定芽的增殖，生根培养以及炼苗和移栽，具体操作按下列步骤进行：

愈伤组织及不定芽的诱导：

a、取实验室继代生长的新疆野苹果无菌苗40d叶龄大小的幼嫩完全展开叶片为外植体，去掉叶柄部分，用解剖刀垂直于叶片中央叶脉横切，将叶片等分为两部分，以叶片远轴端为接触面，接种到诱导培养基中继代2次，每25天一次，黑暗培养三周后，2000lx光照培养，光照时间16小时，培养温度为24±2℃，培养7天后，肉眼可在切口处见黄色愈伤组织，20天左右在叶片切口处的愈伤组织看到有不定芽的分化，其中诱导培养基为以MS为基础培养基，附加30g/L蔗糖，琼脂6g/L，激素为NAA 0.0-2.0mg/L，TDZ 1.0-5.0mg/L或6-BA 1.0-5.0mg/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；

不定芽的增殖：

b、将步骤a诱导出的不定芽切下，插到不定芽增殖培养基中，培养条件为黑暗培养三周后，2000lx光照培养，光照时间16小时，培养温度为24±2℃，培养15天后长成1-4cm丛生芽或幼苗，增值倍数达3-5倍，其中不定芽增殖培养基为以MS为基础培养基，附加30g/L蔗糖，琼脂6g/L，激素为6-BA 0.4mg/L，NAA 0.0-0.1mg/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；

生根培养：

c、将步骤b得到的3cm幼苗，沿茎基部切下，接种到生根培养基上，约10天可在茎基部看到粉红色的根尖，25天可长出3-5条根，其中生根培养基为以1/2MS为基础培养基，蔗糖15-30g//L，NAA 0.0-1.0mg/L，琼脂6g/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；

炼苗和移栽：

d、取株高5cm，有3-5条根的健壮幼苗移栽到已经湿润的基质中，基质为营养土:蛭石3:1，将幼苗移栽进基质后，在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜，期间每天向膜内喷水，光照强度减半，光照时间为16小时，培养温度为24±2℃，7天后揭开保鲜膜呈半开状态，正常光照下培养且仍需每天向膜内喷水，直至移栽后第一片新叶完全展开，即可完全撤去保鲜膜，此后恢复正常浇水。

2.根据权利要求1所述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，其特征在于步骤a中诱导培养基中的激素为TDZ 4mg/L、NAA 1.0 mg/L。

3.根据权利要求1所述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，其特征在于步骤b中不定芽增殖培养基激素浓度为6-BA 0.4mg/L。

4.根据权利要求1所述一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，其特征在于步骤c中生根培养基为1/2MS+15g蔗糖+0.1mg/L NAA。