[发明专利]酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法

权利要求书

1.一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，采用UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS方法，同时定量测定酸枣仁水提物中9种活性成分：乌药碱、木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B；其特征在于：具体步骤如下：

（1）单一对照品储备液的制备：分别精密称定对照品，加入UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析的色谱初始流动相，制备成乌药碱2.032 mg/mL、木兰花碱1.130 mg/mL的单一对照品储备液，加入甲醇制备成维采宁2.184 mg/mL、斯皮诺素2.016 mg/mL、当药黄素1.972 mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷2.058 mg/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素2.012 mg/mL、酸枣仁皂苷A 2.040 mg/mL、酸枣仁皂苷B 2.064 mg/mL的单一对照品储备液；

工作溶液的制备：分别精密量取上述单一对照品储备液加入甲醇制成混合对照品溶液，其中：乌药碱325.12 ng/mL、木兰花碱18080 ng/mL、维采宁、斯皮诺素2419.2 ng/mL、当药黄素94.66 ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷246.96 ng/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素128.77ng/mL、酸枣仁皂苷A 652.8 ng/mL、酸枣仁皂苷B 412.8 ng/mL；然后精密量取上述混合对照品溶液，分别加甲醇逐级稀释为混合对照品溶液浓度的4/5、1/2、1/4、1/8、1/40、1/80倍，摇匀，即得质量浓度梯度的工作溶液；

（2）内标溶液的制备：选用盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷分别作为生物碱类、黄酮类、皂苷类化合物含量测定的内标物，分别精密称定内标物，加甲醇制备成盐酸巴马汀0.984mg/mL、大豆苷1.080 mg/mL、黄芪甲苷1.392 mg/mL的单一内标溶液；精密吸取单一内标溶液，用甲醇稀释制成含盐酸巴马汀78.72 ng/mL、大豆苷216.00 ng/mL、黄芪甲苷556.80ng/mL的混合内标溶液；

（3）标准曲线的建立：精密吸取空白血浆100 µL，加入10 µL内标，涡旋30 s，再分别加入10 µL混合工作溶液涡旋30 s，然后加入300 µL乙腈涡旋5 min，13000 rpm、4℃离心10min，取上清液350 µL加入到干净的EP管中，1400 rpm真空离心、40℃空气吹干，残渣加100µL初始流动相涡旋2 min，13000 rpm、4℃离心5 min，取上清液进行UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析；以待测成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（y），血浆中加入的待测成分对照品的浓度作为横坐标（x），采用1/c²加权最小二乘法进行线性回归，建立曲线；9种待测成分的标准曲线、相关系数、线性范围和LLOQ的结果见下表，结果显示待测成分在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数r²在0.980～0.999；

；

（4）样品的检测：

（a）酸枣仁水提物的制备：酸枣仁饮片500 g，粉碎至60%过1号药典筛，加10倍量水，浸泡30 min，加热至沸，回流提取2 h，滤过，滤渣再加8倍量水，加热回流提取2 h，滤过，合并滤液；减压浓缩至以生药量计浓度为0.5 g/mL，冷冻干燥，用时用水溶解；

（b）血浆样品的采集：大鼠口服酸枣仁水提物以生药量计浓度为40 g/Kg，给药后于0.083－24 h期间对大鼠采血300 µL，置于含0.1%的肝素钠抗凝剂的离心管中，静置30min，4℃、3500 rpm离心10 min，分离血浆，置-20℃保存，待用；

（c）样品的检测：精密吸取大鼠血浆100 µL，采用空白血浆样品的处理方法进行处理，血浆样品处理中采用的溶剂为乙腈，用量为血浆样品的3倍；将处理好的含药血浆样品进行UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析，根据标准曲线计算血浆样本中9种成分的浓度；

所述UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析的色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC®HSS T3柱，150 mm×2.1 mm，1.8 µm，流动相A：B为乙腈：0.1%甲酸水或A：B为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.5 min，17% A；1.5～3 min，17→19% A；3～7 min，19→33% A；7～12 min，33→98% A；12～14 min，98→17% A；14～19 min，17% A；流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为3 µL；

质谱条件：离子源：HESI源；正、负离子切换同时扫描；工作模式：Full-MS；质谱参数：鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；喷雾电压：+ 3.2 KV、- 2.5 KV；毛细管温度：320℃；离子源温度：300 ℃；分辨率70 000；扫描范围 m/z 150-1500 Da。

2.根据权利要求1所述的一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，其特征在于：所述步骤（b）中分别在大鼠给药后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6、10、12、24 h对大鼠进行采血。