[发明专利]一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法

说明书

本发明公开了一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，属于生物技术的细胞培养领域。所述方法包括：采集外周血，得到外周血来源单个核细胞；将细胞接种到包含RetroNectin和CD3Mab的培养器皿中，加入无血清细胞培养基培养。本发明无血清细胞培养基包含谷氨酰胺、巯基乙醇和IFN‑γ，以及转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠、胆固醇，可以促进单个核细胞大量扩增，获得足够数量的外周血来源单个核细胞。本发明同现有技术相比，采用先包被RetroNectin和CD3抗体，后加入INF‑γ、IL‑2以及SUPERGROW细胞培养添加物，通过包被使得细胞更持久的接触抗体，用量少、激活效果更好。

技术领域

本发明属于生物技术的细胞培养领域，具体涉及一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法。

背景技术

免疫细胞，泛指能产生免疫应答的细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、杀伤细胞、自然杀伤细胞等。目前，肿瘤和病毒的免疫治疗技术慢慢地应用到临床上。如肿瘤过继免疫疗法和“癌症疫苗”等，这些方法主要通过采集宿主的自体免疫细胞，然后经过体外诱导刺激、扩增培养，然后回输来提高患者的免疫能力，这些细胞主要有CIK细胞、NK细胞、DC细胞、DC-CIK细胞等。

但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭癌症细胞的情形；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免疫功能；此外，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤。癌症的免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的目的。

外周血是除骨髓之外的血液，来源丰富，采集方便。通过外周血分离培养的免疫细胞具有增殖速度快、安全性、持久性、适应性、全身性等特点，与传统的放疗等方法相比，通过主动免疫能够激发全身性的抗肿瘤效应，作用范围更加广泛，特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤；副作用很小。

目前免疫细胞主要来源于脐血、外周血、骨髓，但是脐血和骨髓来源的免疫细胞在体内存活率低、抗凋亡能力差、容易产生不良反应、安全性较差。而且同量的脐血、外周血、骨髓血中，从脐血和骨髓血中分离的免疫细胞较少。

而现有技术中分离培养外周血来源的免疫细胞时，常规方法通常效率低下，扩增能力不高，不容易获得足够的免疫细胞；此外，细胞活性低、在宿主体内的免疫功能达不到预期。此外，现有外周血来源的细胞分离方法中，不能充分分离红细胞和免疫细胞，获得的细胞诱导后状态不是很好。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高机体免疫功能的外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，包括下列步骤：

(1)无菌采集外周血，进行抗凝处理。

(2)加入淋巴细胞分离液，500×g～1500×g离心5～15min，取上层血浆和白膜层；再400×g～800×g低速离心5～15min，得到的细胞沉淀为外周血来源单个核细胞。

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包含免疫细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞。

本发明中采用的淋巴细胞分离液是Lymphoprep分离液，STEMCELL Technologies公司生产。本领域技术人员也可以采用别的淋巴细胞分离液。