[发明专利]一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法在审
| 申请号： | 201811208217.6 | 申请日： | 2018-10-17 |
| 公开（公告）号： | CN109402053A | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 黎天英 | 申请（专利权）人： | 广州元帅生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/078 | 分类号： | C12N5/078 |
| 代理公司： | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 | 代理人： | 胡辉 |
| 地址： | 510520 广东省广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 单个核细胞 外周血 无血清细胞培养基 诱导培养 包被 细胞培养 细胞培养添加物 丙酮酸钠 谷氨酰胺 培养器皿 细胞接种 转铁蛋白 巯基乙醇 胰岛素 胆固醇 抗体 扩增 生物技术 采集 激活 细胞 | ||
1.一种外周血来源单个核细胞的分离及诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
无菌采集外周血，进行抗凝处理；
加入淋巴细胞分离液，500×g～1500×g离心5-15min，取上层血浆和白膜层；再400×g～800×g低速离心5-15min，得到细胞沉淀；
将细胞接种到培养器皿中，所述培养器皿有包含RetroNectin和CD3Mab的缓冲液；
加入无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基的成分包括1～10mmol/L谷氨酰胺、30～70μmol/L巯基乙醇、500～1500u/mL的IFN-γ、0～800μ/ml转铁蛋白、0～800μ/ml胰岛素、0～800μ/ml丙酮酸钠、0～5μg/ml胆固醇；进行培养；
第0天加入500～1500u/mLIFN-γ、2～6％的SUPERGROW细胞培养添加物，24h后加入500～1500u/mL IL-2、2～6％SUPERGROW细胞培养添加物；
适时转移细胞到新的培养器皿中，并补充无血清细胞培养基、IL-2以及SUPERGROW细胞培养添加物。
2.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：抗凝处理是采用肝纳素或EDTA进行抗凝处理。
3.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：淋巴细胞分离液需要调整到室温后，再加入到外周血中。
4.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：缓冲液中RetroNectin的浓度为50～100mg/L，CD3Mab的浓度为5～10mg/L。
5.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：所述无血清细胞培养基的成分包括2～8mmol/L谷氨酰胺、30～50μmol/L巯基乙醇、700～1300u/mL的IFN-γ、0～600μ/ml转铁蛋白、0～600μ/ml胰岛素、0～600μ/ml丙酮酸钠、0～3μg/ml胆固醇。
6.根据权利要求1所述的分离及诱导培养方法，其特征在于：第0天以及24h后，SUPERGROW细胞培养添加物的添加量为2～4％，按质量百分比计。
7.一种外周血来源单个核细胞，其特征在于：所述外周血来源单个核细胞是由权利要求1-6任一项分离得到。
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