[发明专利]用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体，所述重组载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA序列，3’末端反相重复序列。经过发明人研究发现，CXCL12基因敲除载体可以有效抑制U87细胞胶质瘤模型的移植瘤生长及肿瘤血管生成，能够有效抑制U87细胞裸鼠皮下胶质瘤模型的肿瘤生长及肿瘤的血管生成。说明本发明的技术方案可以适用于胶质瘤疾病的治疗。

技术领域

本发明涉及一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

CXCL12又称基质细胞衍生因子－1(SDF-1)是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。CXCL12与其受体(CXCR4)在很多生理和病理的发生发展中发挥重要的作用，在肿瘤中通过不同途径使细胞内信号发生改变，能够促进肿瘤细胞的增殖、运动、粘附、侵袭。影响肿瘤的发生、发展和预后。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺相关病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。人2型腺相关病毒伴随病毒(AAV-2)的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73和61kDa，在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。

近年来，AAV载体在临床试验上的安全性和良好治疗效果使人们对AAV载体的研究和开发充满了信心。随着AAV载体的研究和开发不断深入，其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性不强和转导效率不高等问题，通过改造AAV外壳蛋白，利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一定的解决。日前欧洲监管机构建议批准由荷兰uniQure公司研制和申报的基因治疗药物Glyber上市。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近期出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用。

1971年，Judah Folkman博士首次提出了“肿瘤生长依赖于血管生成(tumorangiogenesis)”的观点：一旦肿瘤发生，任何数量的肿瘤细胞增加，都必将伴有新毛细血管的形成。新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给，同时它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径；而在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散。这就是严重地限制了肿瘤细胞的生长。