[发明专利]一种羟基自由基的比色检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种羟基自由基的比色检测法及其应用，属于检测技术领域，检测试剂中的硝基咪唑与·OH自由基反应释放亚硝酸根，亚硝酸根与Griess试剂反应生成的红色偶氮产物在540nm处具有最大吸光值；该检测方法不仅可以通过UV‑Vis，还可以通过简单的肉眼识别来检测·OH自由基的浓度；另外，本发明还提供了一种简单、直观且易于商品化的试剂盒。

技术领域

本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种羟基自由基的比色检测方法及其应用。

背景技术

活性氧(ROS)由氧气还原形成，其分为自由基氧和非自由氧两大类。ROS在环境和生物过程中起重要作用，其中，羟基自由基(·OH)具有最强的反应活性，因此也常被认为是对生物体最具危害性的活性氧。·OH自由基可导致细胞中脂质、蛋白质、核酸和其他生物分子的氧化损伤。过量接触·OH自由基会导致细胞死亡，这一过程通常与多种疾病的发生与发展有关¹。但是，·OH自由基并不总是有害的，利用·OH促进物质的氧化降解是消除环境污染的重要方法，如通过光电反应产生的·OH自由基可用于水体中有机污染物的降解。此外，·OH自由基是癌症放射治疗(例如X-ray)过程中的主要活性氧成分之一，其起到杀死肿瘤细胞的作用^2-3。因此，·OH自由基的检测至关重要。

由于羟基自由基寿命极短且反应过程不易控制，这给·OH的检测带来困难⁴。目前国内外已经建立了若干种·OH自由基的检测方法，其包括电化学法^5-6、电子自旋共振法(EPR)^7-8、化学发光法^9-11、紫外-可见光谱法和荧光光谱法^12-16以及基于纳米颗粒的荧光探针法^17-21。基于电化学和电子自旋共振的检测方法，因其选择性差以及操作过程复杂等原因，其在实际检测中并不常用。近年来发展起来的基于荧光的检测方法，虽然具有可在细胞内进行检测的优点，但是大多数荧光体系的建立依赖于复杂的有机合成过程，且检测高度依赖于仪器的辅助。

紫外-可见光谱法是一种可视化比色检测法，其已被用于各类检测物的分析，其中包括活性氧物质。前人研究发现亚甲基蓝可被Fenton反应产生的自由基氧化降解形成无色产物，为可视化检测提供了可能¹⁵。金属染料复合物固蓝BB盐(FBBs)亦可通过与Fenton产生的·OH自由基反应生产无色产物进而实现·OH自由基的检测¹⁴。但是由于反应的复杂性和褪色型方法的固有缺点，这两种方法的检测灵敏度非常有限，仅适用于几十微摩尔每升浓度范围内的检测。因此，仍然需要更灵敏和更可靠的比色检测法来实现·OH自由基浓度的测定。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种羟基自由基的比色检测方法及其应用，该检测方法更灵敏和更可靠。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种羟基自由基的比色检测法，其包括以下步骤：

S1)配置羟基自由基标准液；

S2)向羟基自由基标准液和样品中分别加入硝基咪唑溶液，反应生成亚硝酸根离子；

S3)再将步骤S2反应生成的亚硝酸根离子加入对氨基苯磺酰胺磷酸溶液和N-1-萘基乙二胺水溶液的混合溶液中，室温避光条件下反应后测定吸光值；

S4)绘制羟基自由基标准液的标准曲线，并计算样品中羟基自由基的浓度。

本发明比色检测方法是在传统Griess方法的基础上建立了一种简单且灵敏的·OH自由基检测方法nIm-Griess法，检测过程中使用三种试剂：与羟基自由基反应生产亚硝酸根的硝基咪唑、与亚硝酸根离子反应生成活性重氮盐的对氨基苯磺酰胺以及与重氮盐反应形成红色产物的N-1-萘基乙二胺。在nIm-Griess比色检测中，羟基自由基与硝基咪唑的硝基取代碳原子发生加成反应，进而导致亚硝酸根释放，亚硝酸根可通过Griess试剂进行定量。