[发明专利]一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系及其构建方法，是以猪子宫内膜上皮细胞作为宿主细胞，转染带有SV40T抗原基因的慢病毒表达质粒，经Puromycin药物筛选、细胞扩大培养后获得。本发明构建的猪子宫内膜上皮细胞系具有无限传代的功能，且能维持猪子宫内膜上皮细胞的特性，在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化；而且，该猪子宫内膜上皮细胞系对PRRSV病毒敏感，可以用于PRRSV的传代以及相关的研究。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸障碍综合症，又叫猪蓝耳病，在猪的生产过程中造成巨大损失。该病由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)引起。该病只感染猪，其他动物不会感染此病毒，而且各个年龄和品种的猪都可以感染此病毒，其中以怀孕母猪和一月内的仔猪最为易感。临床上以妊娠母猪流产和胎儿的早产为特征性症状。前期研究表明，感染了PRRSV病毒的胎儿会因为胎盘细胞的凋亡而造成流产。而子宫内膜与胎儿胎盘对于妊娠的建立和维持起着重要作用。有研究提出，胎儿的细胞膜，母体的子宫内膜上皮细胞的凋亡与妊娠的终止和失败有重要的关系。但受限于猪子宫内膜上皮细胞在每一次发情周期中的不断变化，迄今为止，猪的子宫内膜上皮细胞系仍然没有成功建立。

在前期细胞系的建立方法中，端粒酶和SV40大T抗原的方法是两种最常见的方法。端粒酶的方法是基于端粒的延长从而达到细胞系构建的目的，端粒酶的构建方式更有利于维持构建好的细胞系的生物学特性。但受限于子宫内膜上皮细胞的传代次数，目前利用端粒酶的技术来构建尚不成熟。而SV40大T抗原细胞系的构建方法则是使细胞向肿瘤化转变从而达到细胞系的构建条件，但SV40大T抗原方法构建的细胞系在长期传代的过程中，可能会伴有核型的改变。

由于至今仍没有治疗猪蓝耳病的特效药，所以疫苗成为控制PRRSV爆发及传播的有效方法和主要手段。PRRSV具有很强的宿主细胞嗜性，目前用于分离和培养PRRSV的细胞主要是猪肺泡巨噬细胞(PAM)和非洲绿猴肾细胞(Marc-145)，但PAM并不是与子宫和胎盘相关的细胞；Marc-145来源于猴，而非猪来源细胞，会导致PRRSV体外研究受限于不能反应自然宿主细胞的感染情况。因此，亟需构建新的PRRSV易感的猪来源的子宫内膜上皮细胞系，以模拟PRRSV感染自然宿主细胞的过程，扩大研究范围。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系及其构建方法。本发明构建的猪子宫内膜上皮细胞系具有无限传代的功能，且能维持猪子宫内膜上皮细胞的特性，在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化；而且，该猪子宫内膜上皮细胞系对PRRSV病毒敏感，可以用于PRRSV的传代以及相关的研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系，是以猪子宫内膜上皮细胞作为宿主细胞，转染带有SV40T抗原基因的慢病毒表达质粒，经Puromycin药物筛选、细胞扩大培养后获得。

优选的，所述慢病毒表达质粒包含：SV40大T抗原基因、抗生素筛选基因Puro基因和EGFP基因。

更优选的，所述慢病毒表达质粒为pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T。

本发明的第二方面，提供上述猪子宫内膜上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)获得原代猪子宫内膜上皮细胞，并进行培养；

(2)以pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，获得慢病毒颗粒；

(3)采用慢病毒颗粒转染培养后的原代猪子宫内膜上皮细胞；