[发明专利]一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系，其特征在于，是以猪子宫内膜上皮细胞作为宿主细胞，转染带有SV40T抗原基因的慢病毒表达质粒，经Puromycin药物筛选、细胞扩大培养后获得。

2.根据权利要求1所述的猪子宫内膜上皮细胞系，其特征在于，所述慢病毒表达质粒包含：SV40大T抗原基因、抗生素筛选基因Puro基因和EGFP基因。

3.根据权利要求2所述的猪子宫内膜上皮细胞系，其特征在于，所述慢病毒表达质粒pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T。

4.权利要求1-3任一项所述的猪子宫内膜上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得原代猪子宫内膜上皮细胞，并进行培养；

(2)以pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，获得慢病毒颗粒；

(3)采用慢病毒颗粒转染培养后的原代猪子宫内膜上皮细胞；

(4)慢病毒颗粒转染猪子宫内膜上皮细胞后，在含血清的DMEM/F12培养液中添加终浓度为2μg/ml的Puromycin进行细胞筛选，获得阳性细胞；

(5)将筛选的阳性细胞用不含Puromycin的培养液扩大培养，即构建得到对PRRSV易感的猪子宫内膜上皮细胞系。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，获得原代猪子宫内膜上皮细胞及培养的方法为：采集猪子宫内膜，将猪子宫内膜剪碎成小的组织碎片，直接接种至细胞培养皿，不加培养液放入培养箱中10-20min；取出后加入少量培养液，继续培养箱中培养，4h后补液至没过组织块，同时添加青霉素和链霉素，隔天换液一次；

优选的，所述青霉素的加入量为100U/ml，链霉素的加入量为100μg/ml。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T、psPAX2和pCMV-VSV-G共同转染进入293T细胞，48h后收获上清；72h后收获上清和细胞，并与之前收获的上清混合，反复冻融使细胞破裂，过滤，收集上清液，将上清液与PEG8000混合，沉降过夜，离心，去除上清，将沉淀用DMDM培养液溶解，即获得慢病毒颗粒。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，待原代猪子宫内膜细胞培养至第七天时，进行慢病毒颗粒转染。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，在进行慢病毒转染时，同时加入5μg/ml的polybrene。

9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，将筛选的阳性细胞用不含Puromycin的培养液扩大培养50代以上。

10.权利要求1-3任一项所述的猪子宫内膜上皮细胞系在分离和/或培养PRRSV中的应用。