[发明专利]应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒及检测方法，该试剂盒其由实时荧光定量PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和布鲁氏菌属特异性上下游引物组成。其中，上游引物qBSF1如SEQ ID NO：1所示，下游引物qBSR2如SEQ ID NO：2所示。本发明检测试剂盒相较于消防部队现有的检测试剂，本发明试剂盒有利于保存和运送，检测方法更为简便。同时本发明检测试剂盒特异性强，灵敏度高，检测结果重复性好，差异性小，另外试剂易于保存。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌可以感染人和牲畜造成布鲁氏菌病，在我国布鲁氏菌病属于乙类传染病，世界卫生组织将其定位B类传染病，传染性强，对人类伤害大，由于布病反复发转为慢性后，会留下后遗症导致终身残疾，且会传染给下一代，至今全世界有170余个国家和地区报告过疫情。我国虽然强制干预，布病疫情依然以目前两位数的百分比速率增长，对我国经济建设，人民健康，国家安全带来了严重威胁。

随着我国消防队应急管理职能的不断拓展，消防部队经常参与各类大型活动的安保以及国家反恐、处突的行动中。而生物恐怖由来已久，给全世界人民带来了巨大伤害，反生物武器、反生物恐怖是国家安全的重要组成部分。

但是，在我国国内尚没有针对消防部队等处置生物恐怖事件所建立的生物侦检方法，现在所使用的仪器和材料需要全部从国外进口，不仅操作复杂操作难度大，检测费用高昂。

因此，现有技术有待于进一步发展。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒及检测方法，以实现对布鲁氏菌生物恐怖战剂简便、高效、灵敏、快速、稳定的检测，其技术方案如下。

一种应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其中，该试剂盒由PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和布鲁氏菌属特异性上下游引物组成，其中，上游引物qBSF1:5-GCCGATAAATCTTTCCCCCG-3，如SEQ ID NO：1所示；下游引物qBSR2:5-GCGGCAGGCTTAACACATGC-3，如SEQ ID NO：2所示。

所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其中，实时荧光定量PCR反应液为Sybr green qPCR mix。

所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其中，所述阳性对照品制备方法如下：克隆目的基因片段，目的片段纯化回收，与T/A克隆载体pGSI-T连接，转化大肠杆菌Top10，在含有氨苄青霉素钠LB平板上抗性筛选，挑取菌落转入LB液体培养基培养，提取重组质粒，酶切鉴定，测序后，将重组质粒作为阳性对照品，其中，所扩增目的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。其中，根据Aidlab高纯质粒小量快速提取试剂盒的操作步骤提取质粒，具体提取步骤如下：

1)取过夜培养的重组大肠杆菌菌液2mL于离心管中，设置离心条件12000rpm离心30s，离心结束后去上清，收集菌体；

2)加入250μL溶液P1，旋涡震荡至菌体悬浮；

3)加入250μL溶液P2，温和的上下摇晃8次；

4)加入350μL溶液P3，迅速温和的上下摇晃8次；

5)将溶液离心13000rpm离心10min，之后取出收集管，将吸附柱置于收集管中，小心吸取上清液于吸附柱上；将收集管盖好离心，再次12000rpm离心1min，之后倒掉收集管中液体，将吸附柱放置收集管中；

6)加入500μL去蛋白液于吸附柱中，将收集管离心12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放置收集管中；