[发明专利]应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由实时荧光定量PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和布鲁氏菌属特异性上下游引物组成，其中，上游引物qBSF1:5-GCCGATAAATCTTTCCCCCG-3，如SEQ ID NO：1所示；下游引物qBSR2:5-GCGGCAGGCTTAACACATGC-3，如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，PCR反应液为Sybr green qPCR mix。

3.根据权利要求1所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品制备方法如下：克隆目的基因片段，目的片段纯化回收，与T/A克隆载体pGSI-T连接，转化大肠杆菌Top10，在含有氨苄青霉素钠LB平板上抗性筛选，挑取菌落转入LB液体培养基培养，提取重组质粒，酶切鉴定，测序后，将重组质粒作为阳性对照品，其中，所扩增目的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求3所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，重组质粒鉴定具体为：对提取得到的重组质粒PCR扩增后进行凝胶电泳反应检测扩增产物是否如预期，其中，预期的扩增目的基因长度为121bp。

5.根据权利要求4所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系为20μL，包括：Sybr Green qPCR mix 10μL，上下游引物各0.8μL，上下游引物浓度均为10μmol·L^-1，超纯水7.4μL，底物1μL。

6.根据权利要求5所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR反应条件为：94℃5min；变性94℃持续10s；退火延伸59℃持续30s，扩增40个循环，扩增阶段温度变化速率20℃/s。

7.根据权利要求1所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为超纯水。

8.利用如权利要求1-7任一项所述的应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，检测步骤为：

1)确定需要检测的阳性对照、待测样本、阴性对照，每组样本至少进行2个复孔的重复，确定进行实时荧光定量检测的孔数为n；用移液枪分别吸取n×10μL Sybr green qPCR mix和n×0.8μL的上下游引物和n×7.4μL的超纯水至带有2mL容量的离心管中；

2)将离心管震荡混匀后，选择3000rmp，离心30s后，静置两分钟；

3)取必要量的毛细管装入冷却的Light Cycler适配块中，用移液枪将19μL的混合液移至每个毛细管中；

4)用移液枪分别将1μL阳性对照、阴性对照、待测样本移至每个毛细管中，并对每个毛细管进行加盖；

5)将装有毛细管的适配器放入离心机，3000rpm，离心15s；

6)取出毛细管放入定量仪转子中，将转子放入荧光定量仪进行检测。

9.根据权利要求8所述应用于生物恐袭现场布鲁氏菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，采集样本进行处理：打开采样瓶，使用移液枪吸取1mL采集样本到一个离心管中，首先将离心管放入离心机进行离心，3000转/分离心5min，使用移液枪吸取上清液转入一个新的离心管中，再将离心管离心，13000转/分离心30s吸取下层液体，得到待检测样品。