[发明专利]一种肠毒素性大肠杆菌的特异性标记方法

说明书

本发明涉及一种肠毒素性大肠杆菌的特异性标记方法，以红色荧光蛋白基因作为报告基因，利用CRISPR/Cas9系统将RFP基因定点敲入肠毒素性大肠杆菌基因组中。本发明构建的特异性标记的肠毒素性大肠杆菌能够实现对病原性大肠杆菌的特异性识别和监测，为研究肠毒素性大肠杆菌在体内的侵染途径和致病机理提供方法学基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种病原菌的荧光标记，更具体涉及一种肠毒素性大肠杆菌的特异性标记方法，特别涉及一种运用CRISPR/Cas9技术将红色荧光蛋白敲入肠毒性大肠杆菌建立ETEC特异性标记的方法。

背景技术

肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一类引起人和幼畜腹泻的重要病原菌，发病率和死亡率均很高，是目前的研究热点之一，该菌的致病性与其具有黏附素和产肠毒素密切相关。

目前国内外针对肠毒素性大肠杆菌ETEC构建攻毒模型，对病原菌进行标记，实现实时监测，能够直接观察其在动物体内的分布、定植、感染等生物学过程。如Corr等(2007)采用lux基因标记的单核增生李斯特菌作为攻毒模型阐明了唾液乳杆菌UCC118分泌产生细菌素是其体内抗感染的作用机制；杨藩等(2014)建立了一种转lux基因簇大肠杆菌在小鼠肠道内定植模型。结果发现动物肠道自发的蓝绿色等短波荧光比较强，对外源的病原菌的实时成像和监测干扰非常大。此外，这种报告基因在应用于动物攻毒模型时，荧光质粒容易丢失，而维持质粒的稳定性时都需要维持一定的抗性压力，因此这种攻毒模型难以反映外源菌株在动物胃肠道内实际情形。这些模型缺乏通用性，标记的菌株特异性不强，稳定性差，在实际检测中亦不能实现高灵敏检测。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas系统是近年来新兴的一个基因组定点编辑技术。这一技术成功应用于对多种生物基因组的定点敲除、敲入或是突变，是一种有效的基因编辑工具。

发明内容

为解决上述问题，本发明基于CRISPR/Cas9技术，以肠毒性大肠杆菌ETEC作为病原菌实现外源红色荧光蛋白RFP定点插入，实现了肠毒素性大肠杆菌的特异性标记。具体而言：

一方面，本发明提供一种大肠杆菌标记方法，其特征在于将红色荧光蛋白基因定点敲入大肠杆菌染色体上可插入外源基因的假基因位点处，所述假基因位点处红色荧光蛋白基因的敲入不改变大肠杆菌的生物学性能。

本发明所述的大肠杆菌标记方法，其中所述大肠杆菌为肠毒素性大肠杆菌，所述定点敲入使用CRISPR/Cas系统，所述假基因位点选自yaiT、yaiX、ygeO、yheO、wbbL和ykgA，优选为yheO。

具体而言，本发明所述的大肠杆菌标记方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肠毒素性大肠杆菌的鉴定；

(2)假基因位点的选择和验证；

(3)设计sgRNA靶点引物并构建基因编辑载体；

(4)基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除；

(5)RFP定点敲入标记的肠毒素性大肠杆菌的验证。

本发明所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤(1)包括根据大肠杆菌肠毒素基因保守序列设计引物，以大肠杆菌DNA为模板进行PCR扩增，选择具有肠毒素基因的大肠杆菌作为进行特异性标记的目标菌株。

本发明所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤(2)包括参考大肠杆菌K12基因序列，进行生物信息学分析获得候选假基因位点；根据候选假基因序列设计引物，以步骤(1)中的肠毒素性大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，确认所述肠毒素性大肠杆菌基因组含有的假基因位点，将其作为红色荧光蛋白基因定点敲入。