[发明专利]一种肠毒素性大肠杆菌的特异性标记方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌标记方法，其特征在于将红色荧光蛋白基因定点敲入大肠杆菌染色体上可插入外源基因的假基因位点处，所述假基因位点处红色荧光蛋白RFP基因的敲入不改变大肠杆菌的生物学性能；

所述定点敲入使用CRISPR/Cas系统，所述假基因位点为yheO；

所述CRISPR/Cas系统中的向导序列gRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：8。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌标记方法，其中所述大肠杆菌为肠毒素性大肠杆菌。

3.如权利要求2所述的大肠杆菌标记方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）肠毒素性大肠杆菌的鉴定；

（2）假基因位点的选择和验证；

（3）设计sgRNA靶点引物并构建基因编辑载体；

（4）基因编辑菌株的筛选及基因编辑载体的去除；

（5）RFP基因定点敲入标记的肠毒素性大肠杆菌的验证。

4.如权利要求3所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤（1）包括根据大肠杆菌肠毒素基因保守序列设计引物，以大肠杆菌DNA为模板进行PCR扩增，选择具有肠毒素基因的大肠杆菌作为进行特异性标记的目标菌株。

5.如权利要求3所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤（2）包括参考大肠杆菌K12基因序列，进行生物信息学分析获得候选假基因位点；根据候选假基因序列设计引物，以步骤（1）中的肠毒素性大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，确认所述肠毒素性大肠杆菌基因组含有的假基因位点，将其作为红色荧光蛋白基因定点敲入点。

6.如权利要求3所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤（3）包括根据步骤（2）选出并验证的假基因位点序列设计sgRNA，构建pTargetF-sgRNA载体；通过同源重组构建含有外源基因RFP的基因编辑载体。

7.如权利要求3或6所述的大肠杆菌标记方法，其中所述基因编辑载体构建为通过设计引物利用重叠延伸PCR将T5启动子、目的基因RFP基因、左右同源臂以及片段J23119(SpeI)-sgRNA-gRNA scaffold相连，最后与Kpn I和Sph I双酶切线性化载体 pUC57进行连接反应。

8.如权利要求3所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤（4）包括制备ETEC-Cas9感受态，将步骤(3)中的基因编辑载体转化至ETEC-Cas9感受态中，进行基因编辑菌株筛选；经过PCR验证后，挑选成功敲入的单克隆加入诱导剂，30℃震荡培养过夜，去除Donor载体；42℃培养处理16 h，去除pCas9载体。

9.如权利要求3或8所述的大肠杆菌标记方法，其中基因编辑菌株的筛选包括将ETEC-Cas9感受态转化基因编辑载体后分别涂布无抗、Kan抗性、Amp抗性LB平板，编辑成功的克隆在无抗性平板上有菌落生长，在Kan抗性与Amp抗性平板上无菌落生长。

10.如权利要求3所述的大肠杆菌标记方法，其中步骤（5）包括测序验证RFP基因成功敲入，荧光显微镜下验证红色荧光蛋白表达。

11.如权利要求1-10任一所述大肠杆菌标记方法制备的红色荧光蛋白特异性标记的大肠杆菌。

12.如权利要求11所述标记的大肠杆菌，其特征在于：当在培养基中加入3-7 g/L乳糖进行诱导表达，在荧光显微镜下镜检可以看到大肠杆菌ETEC活细胞中表达红色荧光蛋白；采用荧光分光光度计法进行特异性检测，其检出限在10⁴ -10⁵ CFU/mL。