[发明专利]一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系的建立方法，选取生长18～22天左右的中间锦鸡儿幼苗，使用1mL无针头注射器，在叶片的背面将农杆菌悬浮液注入叶片内，注射完后，黑暗覆膜24h，揭膜后继续黑暗处理2天，剪取侵染后1～11天样品进行GUS染色，在转化后4天即可观察到GUS报告基因在中间锦鸡儿叶片中的表达，在转化6天时表达量最高，此外，加入Silwet L‑77表面活性剂后GUS报告基因的表达要比不加以及加入其它表面活性剂的效果要好。本发明适用于叶片蜡质层较厚，叶片较小的植物，操作简单，表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系的建立方法。

背景技术

植物细胞瞬时表达是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术，能够方便、快捷的研究基因启动子活性、基因功能和蛋白质定位等。植物瞬时表达技术不需要通过长时间的转基因植物的筛选、传代，非常适用于再生困难的植物。与稳定表达相比，瞬时表达具有操作简单、周期短、表达效率高等优点。最早建立农杆菌介导的瞬时表达体系的植物是烟草，现在已经应用于许多植物中，包括拟南芥、大豆、百脉根、水稻、番茄、葡萄、大白菜等。

现如今，豆科植物的瞬时表达体系的研究还比较少，构建成功的例子也不是很多，研究较多的豆科植物有大豆、豌豆以及百脉根等，而中间锦鸡儿瞬时表达体系目前还没有人进行系统的研究。目前，植物瞬时表达方法主要有农杆菌介导的真空渗透法和注射法、基因枪法和原生质体电转化法。有学者对大豆瞬时表达最优条件进行了摸索，发现真空渗透配合一定时间的超声辅助侵染法能够提高农杆菌介导的GUS基因的表达，但是转化效率并不是很高。此外，使用注射渗透法侵染大豆叶片，发现GUS基因表达微弱，表达不一致，并且仅发生在叶组织中的一小部分。

中间锦鸡儿(Caragana intermedia Kuang.)系豆科锦鸡儿属旱生落叶灌木，主要分布于我国内蒙古、宁夏及陕西北部的干旱半干旱的荒漠地区。锦鸡儿属植物具有抗寒、抗旱、耐盐碱、耐瘠薄等特点，对沙漠地区有很强的适应能力，既保持水土、防风固沙，还有较高的饲用价值。虽然中间锦鸡儿还没有完善的基因组数据库，但是从转录组数据库中筛选具有抗逆价值的基因并完成功能验证已经不是一个不可能完成的任务。但是由于缺乏再生体系和转基因技术，迫切需要在中间锦鸡儿中发展基于瞬时表达技术的基因功能验证方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种在中间锦鸡儿中实现基因瞬时表达的方法，用于基因的功能验证研究。通过以下技术方案来实现：

(1)将含有GUS报告基因的表达载体电转化入农杆菌GV3101感受态细胞中；

(2)配置1/2MS液体培养基；

(3)将(1)中得到的农杆菌以及不含有任何外源载体的农杆菌GV3101在LB液体培养基过夜培养至OD所需浓度，再用(2)中的培养基将菌体稀释到所需OD值，静置数小时，

(4)选取生长18～22d左右的中间锦鸡儿幼苗，剪去不适宜注射的叶片，将(3)制备所得的农杆菌悬浮液缓慢的注射入叶片背面，使菌液充满叶片。

(5)瞬时转化后观察2-11d时间内中间锦鸡儿叶片GUS报告基因表达情况。

所述步骤(1)具体为：所用到的含有GUS报告基因表达载体为pCambia1305.2，农杆菌GV3101。

所述步骤(2)具体为：1/2MS培养基配方为：

KOH-HCl调pH值至5.8，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。