[发明专利]一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将含有GUS报告基因的表达载体电转化入农杆菌GV3101感受态细胞中；所用到的含有GUS报告基因表达载体为pCambia1305.2；

(2)配置1/2MS液体培养基；具体配方为：

KOH-HCl调pH值至5.8，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；在1/2MS培养基中加入终浓度为100mmol/L乙酰丁香酮，其配制方法为：称取0.3924g乙酰丁香酮，溶解并定容于20mLDMSO内，分装至1mL离心管内，-20℃保存备用；在1/2MS培养基中加入浓度为0.01％SilwetL-77；

(3)将(1)中得到的农杆菌以及不含有任何外源载体的农杆菌GV3101在LB液体培养基过夜培养至OD所需浓度，再用(2)中的培养基将菌体稀释到所需OD值，静置数小时；

(4)选取生长18～22d左右的中间锦鸡儿幼苗，剪去不适宜注射的叶片，将(3)制备所得的农杆菌悬浮液缓慢的注射入叶片背面，使菌液充满叶片；具体为：在正常生长条件下，选取生长18～22天左右的中间锦鸡儿幼苗，将不适宜注射的叶子减掉，选取较平展的，完整的叶子进行注射；使用1mL无针头的针管吸取静置3～4h的农杆菌悬浮液，吸满后中等力度按压针管，在叶片的背面通过气孔将农杆菌悬浮液注入叶片内，直至菌液充满整个叶片，叶片呈半透明状证明菌液已经全部注入叶片中，注射完后，黑暗覆膜24h，揭膜后继续黑暗处理2天；

(5)瞬时转化后观察2-11天内中间锦鸡儿叶片GUS报告基因表达情况。

2.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌GV3101在LB液体培养基中过夜培养后，OD₆₀₀≈1.3，且使用步骤(2)中得到的1/2MS液体培养基将菌体重悬至OD₆₀₀＝0.7～0.8。

3.根据权利要求2所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，将菌体重悬至OD所需值后，混匀，黑暗22℃静置3～4h，期间每30min上下颠倒一次菌体。

4.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，侵染后，保持房间湿度为80％左右，温度为22～24℃左右，每隔3～4h对幼苗进进行喷水，在2～11天时间内取中间锦鸡儿叶片检测GUS基因表达情况；每个处理6～8个叶片；随后将叶片放入GUS染色液中染色，GUS染色液配方如下：

(1)0.2M NaH₂PO₄·2H₂O：称取1.56g，用无菌水定容至50mL；

(2)0.2M Na₂HPO₄：称取1.42g，用无菌水定容至50mL；

(3)0.1M K₃Fe(CN)₆：称取0.82g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；

(4)0.1M K₄Fe(CN)₆·3H₂O：称取1.05g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；

(5)100mg/ml X-GLUC：称取5mg X-GLUC，用50μL二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存；100mg/ml X-GLUC现用现配。

5.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，配置100mL GUS缓冲液所需要的试剂体积为：

配制好后可4℃避光保存2个月，保存时间不宜过长。

6.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，100mL GUS缓冲液中加入500μL 100mg/mL X-GLUC，现用现配。

7.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，GUS组织化学染色方法为，GUS染色在37℃培养箱中进行，时间为15～16h；脱色：先用95％乙醇高温，水煮沸，然后断电，温度在90℃以上，脱色3次左右，然后更换新95％乙醇，静置3h左右，脱色至背景颜色为白色，肉眼观察GUS染色情况并拍照。