[发明专利]支链酮糖的生物合成方法

说明书

本发明公开了支链酮糖的方法，首先提供了已知醛缩酶的新功能，该醛缩酶可以催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间的羟醛缩合反应，进而合成支链酮糖，基于此，本发明公布了构建体外多酶级联反应体系催化二羟丙酮合成支链酮糖的方法，转化率达到90％，同时本发明还公布了生产支链酮糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，并运用所获得的重组菌株发酵廉价底物葡萄糖或者甘油合成支链酮糖，产量达到36.3g/L,相比目前化学法合成支链酮糖相比，本发明提出的支链酮糖合成方法，具有底物廉价、环境友好，产物合成效率高、产物单一便于分离的优势，具有工业化应用潜力，为4‑羟甲基糠醛的合成提供基础。

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及支链酮糖的生物合成方法。

背景技术

稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)。支链酮糖属于稀少糖中的一种，自然界中极少存在。 4-羟甲基糠醛是非常重要的医药中间体，该化合物可用于制备斑蝥素(cantharidin)，作为抗肿瘤药物用于肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌等治疗，4-羟甲基糠醛也可以用于制备抗精神分裂症药物，此外，该化合物还可以制备2，4-二甲基呋喃以及C9-C15 的支链烷烃，用于液体燃料。传统方法合成4-羟甲基糠醛主要通过化学修饰呋喃环，然而该方法要求非常苛刻的反应条件，并且所采用的溶液也很昂贵；研究报道支链酮糖脱水之后可以很容易得到4-羟甲基糠醛，反应条件相对简单，并且具有很高的得率，所以开发高效支链酮糖的合成方法对于制备4-羟甲基糠醛具有非常重要的意义。

目前支链酮糖主要通过化学法缩合二羟丙酮来合成(US8455668B2)，然而该方法需要强碱作为催化剂，容易环境污染；催化过程产生少量副产物直链酮糖，增加分离成本；所采用的底物二羟丙酮价格较高，增加生产成本；所以非常有必要开发以廉价底物作为原料、开发环境友好、产物单一的支链酮糖合成方法。

发明内容

本发明目的之一是催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间羟醛缩合反应的醛缩酶，其特征为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD) 可以催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间的羟醛缩合反应。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为(a)或(b)：(a)SEQ ID NO:1，(b)与SEQ ID NO:1具有 70％或以上同源性的序列。

本发明目的之二是提供酶法催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮合成支链酮糖的方法，其特征为采用来源于大肠杆菌的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间的羟醛缩合反应，获得磷酸化的支链酮糖，后者经酸性磷酸酶催化去磷酸化反应之后，生成支链酮糖。

本发明目的之三是提供体外多酶级联催化二羟丙酮合成支链酮糖的方法，其特征为采用由二羟丙酮激酶，L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，果糖1-磷酸酶和聚磷酸激酶组成的多酶体系，以二羟丙酮为底物合成支链酮糖，其中，二羟丙酮激酶催化二羟丙酮磷酸化反应生成磷酸二羟丙酮，该反应以三磷酸腺苷ATP作为辅酶因子；L-鼠李树胶糖-1- 磷酸醛缩酶催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间的羟醛缩合反应生成磷酸化的支链酮糖；后者经果糖1-磷酸酶脱磷酸后得到支链单糖；为了循环使用ATP，构建了由聚磷酸激酶和聚磷酸组成的ATP辅酶再生体系。

在优选的实施方式中，所述体外多酶级联制备支链酮糖的方法，其特征在于，所述的二羟丙酮激酶来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(SEQ ID NO:2)，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和果糖1-磷酸酶(SEQ ID NO:3)来源于大肠埃希氏菌，所述的聚磷酸激酶来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(SEQ ID NO:4)。