[发明专利]支链酮糖的生物合成方法

权利要求书

1.一种醛缩酶的新功能，其特征在于，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)可以催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮之间羟醛缩合反应，进一步经过酸性磷酸化酶催化后得到支链酮糖。

2.一种体外多酶级联反应合成支链酮糖的方法，其特征在于，通过构建体外多酶催化体系，一步法转化二羟丙酮合成支链酮糖。

3.权利要求2所述体外多酶级联合成支链酮糖的方法，其中涉及酶包括可催化磷酸二羟丙酮和二羟丙酮羟醛缩合反应的醛缩酶如L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，果糖1-磷酸酶和聚磷酸激酶。所述酶催化剂物种来源为：二羟丙酮激酶来源于弗氏柠檬酸杆菌，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和果糖1-磷酸酶来源于大肠埃希氏菌，所述的聚磷酸激酶来源于类球红细菌。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体外级联反应体系包括，所述底物二羟丙酮为10-200mM，所述二羟丙酮激酶为0.1-100U/mL,所述L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶为0.1-100U/mL，所述果糖1-磷酸酶为0.1-100U/mL，聚磷酸激酶为0.1-100U/mL，体外级联反应条件为：20℃-37℃，缓冲液pH为6-8，反应1-48小时。

5.一种发酵法生产支链酮糖的微生物重组菌株的构建方法。所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)敲除细胞内的丙糖磷酸异构酶基因，提高胞内磷酸二羟丙酮的含量。

2)引入催化磷酸二羟丙酮转化为二羟丙酮的酶基因，提高胞内二羟丙酮的含量。

3)向微生物重组菌株中引入由L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)和果糖1-磷酸酶组成的羟醛缩合途径。

所述微生物重组菌株的构建方法适用于多种微生物模式菌株，包括大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等微生物。

6.提供用于发酵生产支链酮糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法。所述重组菌株的构建方法包括一下步骤:

1)丙糖磷酸异构酶基因敲除的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6。

2)向重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因，果糖1-磷酸酶基因和磷酸二羟丙酮磷酸酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY30；

3)向重组谷氨酸棒杆菌SY6中引入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因，果糖1-磷酸酶基因，甘油透过酶基因，甘油脱氢酶基因和二羟丙酮激酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY32。

7.权利要求6所述谷氨酸棒杆菌重组菌株SY30在支链酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株SY30菌株可以发酵葡萄糖合成支链酮糖。

8.权利要求6所述谷氨酸棒杆菌重组菌株SY32在支链酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株SY32和SY33菌株可以发酵甘油合成支链酮糖。