[发明专利]基于壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法

说明书

本本发明公开一种基于壳聚糖‑铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用邻苯二酚竞争壳聚糖‑铂纳米粒子的活性位点从而抑制壳聚糖‑铂纳米粒子催化显色反应体系，偶联酪氨酸酶氧化邻苯二酚使显色信号恢复的机制，且结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于酪氨酸酶及其抑制剂含量的测定。在0.5~2.5 U/mL范围内，吸光度变化值△A₄₅₀与酪氨酸酶浓度呈双倒数线性关系，最低检测限为0.5 U/mL。本发明操作简便、灵敏度高，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中酪氨酸酶及其抑制剂含量的测定。

技术领域

本发明涉及壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术

酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能，它与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关。在哺乳动物中，酪氨酸酶常见于黑色素细胞中，黑色素细胞是存在于皮肤、发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞。酪氨酸酶功能减退或缺失时,即会影响黑色素代谢,从而发生如白癫风和白化病等疾病。动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关。因此，对酪氨酸酶进行准确地测定具有重要的临床意义。目前，我国对酪氨酸酶检测方法的种类还相对单一，因此建立一种新型且可行的测定酪氨酸酶的方法在当下的科学研究中具有重要的实际意义。

本发明以邻苯二酚为酪氨酸酶底物，以壳聚糖-铂纳米粒子催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系为检测信号源，建立了一种比色测定酪氨酸酶的方法。该方法简便、快捷，抗干扰能力强、重现性好、不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用壳聚糖-铂纳米粒子催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系，以邻苯二酚为底物，从而测定酪氨酸酶及其抑制剂的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用邻苯二酚竞争壳聚糖-铂纳米粒子的活性位点从而抑制壳聚糖-铂纳米粒子催化显色反应体系，偶联酪氨酸酶氧化邻苯二酚使显色信号恢复的机制，且结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于酪氨酸酶及其抑制剂含量的测定；所使用的壳聚糖-铂纳米粒子是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1 g壳聚糖溶解于50 mL体积分数为1%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到质量浓度为0.2%的壳聚糖溶液；将2 mL浓度为10 mmol/L氯铂酸加入到47 mL浓度为0.2%壳聚糖溶液中,涡旋搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2 mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂纳米粒子，所得产物避光冷藏保存。

一种基于壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶的测定方法，其特征是将邻苯二酚和50 μL不同浓度的酪氨酸酶加入到200 μL pH 7，浓度为10 mmol/L的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应60分钟；然后依次将632.5 μL pH 4.5，浓度为50 mmol/L的磷酸盐缓冲液、50 μL浓度为3 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5 μL壳聚糖-铂纳米粒子溶液加入到上述反应液中，混合均匀后再在37℃下反应5分钟；结束后，立即加入200 μL浓度为2 mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A₄₅₀；在0.5 ~2.5 U/mL范围内，吸光度变化值△A₄₅₀与酪氨酸酶浓度呈双倒数线性关系，最低检测限为0.5 U/mL；所使用的壳聚糖-铂纳米粒子是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1 g壳聚糖溶解于50 mL体积分数为1%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到质量浓度为0.2%的壳聚糖溶液；将2 mL浓度为10 mmol/L氯铂酸加入到47 mL浓度为0.2%壳聚糖溶液中,涡旋搅拌30分钟，然后逐滴加入1 mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂纳米粒子，所得产物避光冷藏保存。