[发明专利]一种生产青蒿素前体的重组菌的构建方法及其发酵工艺

说明书

本发明涉及一种生产紫穗槐‑4,11‑二烯(amorpha‑4,11‑diene)的工程菌的构造方法及工艺。该一种高效生产青蒿素(artemisinin)前体紫穗槐‑4,11‑二烯(amorpha‑4,11‑diene)的菌种，其特征在于：通过调控大肠杆菌自身和外源基因的表达/或活性，得到重组菌；所述基因包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因，HMG‑CoA合酶hmgS基因，HMG‑CoA还原酶hmgR基因，甲羟戊酸激酶mevK基因,磷酸羟脯氨酸激酶pmk基因,甲羟戊酸‑5‑焦磷酸脱羧酶pmd基因，异戊烯焦磷酸异构酶idi基因，法呢基焦磷酸合成酶ispA基因和紫穗槐‑4,11‑二烯合酶ads基因。

技术领域

本发明涉及一种生产紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene)的工程菌的构造方法及工艺。

背景技术

据世界卫生组织公布，在2010一年里，有2.19亿人感染疟疾并有66万死于疟疾感染[World Health Organisation.World Malaria Report 2012(WHO,2012)]。疟疾来自于Plasmodium spp.寄生虫，主要包括Plasmodium falciparum和Plasmodium vivax。其中，Plasmodium vivax对传统的抗疟药物(如氯喹和磺胺多-乙胺嘧啶)已有广泛的抗药性。青蒿素及其衍生物是新一代的速效和低毒抗疟药物，是目前最有效的抗疟组合疗法(antimalarial combination therapies，即ACT)的主要成分之一。青蒿素是中国药学家屠呦呦在1971年从中药青蒿中提取出来的抗疟药物，同时，还有抗肿瘤等作用(正因此，屠呦呦获得拉斯克临床医学研究奖和诺贝尔医学奖)。然而，天然青蒿里的青蒿素含量很低(0.1-0.5％)，并且存在含量差异性较大及自交不亲和性等缺点。同时加下外界自然环境(天气等)及市场需求等波动的影响，使得青蒿的供应不稳定且价格忽高忽低，不利于世界贫困人群的治疗。2012年初价格高达$600/kg，2013年底价格降到$300/kg。价格低时，农民就减少青蒿的种植转而种植其他经济作物，从而加剧市场的不定性和供应的不稳定性。此外，大量栽培青蒿必然会占用更多宝贵的耕地。从可持续发展的目标来看，需要建立一种可持续的、稳定的、污染小、不占用耕地并且具有价格优势的青蒿素生产方法。

目前，通过代谢工程方法将青蒿素生物合成相关基因导入微生物并重构其生物合成途径。该方法最早由美国工程院院士杰·基斯林(Jay D.Keasling)在酵母中构建成功(Nature 496,528–532(2013))，并把相关技术于2013转让于法国赛诺菲公司。然而由于成本过高和价格波动等问题，赛诺菲公司于2015年停止生产青蒿素并将其卖出(Syntheticbiology’s first malaria drug meets market resistance,2016,Mark Peplow,Naturenews)。因此，需要构建一种更加高效和成本低廉的菌种和发酵工艺。借助微生物(如本文的大肠杆菌)生长繁殖快、发酵成本低的特点，可以短期生产大量且廉价的青蒿素。由于微生物方法周期(2-3天)，可以做到按需生产，不必担心供给过剩和价格波动等问题。近几年，青蒿素代谢工程研究取得了迅猛的进展,有望在未来成为生产青蒿素的主要方法。在青蒿素生物合成途径中，紫穗槐-4,11-二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)催化萜类前体FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)形成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene,AD)(图1)。FPP由IPP和DMAPP合成，而IPP和DMAPP可通过两个代谢途径合成，甲羟戊酸途(MVA)和非甲羟戊酸途(MEP)。本文主要采用MVA途径来实现紫穗槐-4,11-二烯的高效生产,并且开发了相应的低成本、易分离的发酵工艺。

发明内容

本发明目的在于开发一种高产紫穗槐-4,11-二烯(青蒿素前体)的工程菌及相应的低成本且易分离的发酵工艺。