[发明专利]一种生产青蒿素前体的重组菌的构建方法及其发酵工艺

权利要求书

1.一种高效生产青蒿素(artemisinin)前体紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene)的菌种，其特征在于：通过调控大肠杆菌自身和外源基因的表达/或活性，得到重组菌；所述基因包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因，HMG-CoA合酶hmgS基因，HMG-CoA还原酶hmgR基因，甲羟戊酸激酶mevK基因,磷酸羟脯氨酸激酶pmk基因,甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶pmd基因，异戊烯焦磷酸异构酶idi基因，法呢基焦磷酸合成酶ispA基因和紫穗槐-4,11-二烯合酶ads基因。

2.根据权利要求1所述的工程菌的构造方法，其特征在于：

1)对整个生物合成途径中所有酶的全局调控进行分组模块化以减少组合数量，每个模块都通过量化的载体或启动子或两者组合来控制。通过筛选不同的载体、启动子和分组模块的组合来得到最优菌种。

2)由于模块分组可能导致单个或几个模块成为整体生物系统的瓶颈。在全局调控的基础上，采用不同强度的5’非翻译区来实现瓶颈模块的内部优化，从而实现对整体生物系统效率的进一步提升。

3.根据权利要求1和2所述的工程菌，其特征在于：所述基因编码分组成模块连接于调控组件，所述编码模块包括:

三个模块的组合，hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi和ads-ispA模块；

或两个模块的组合，hmgS-atoB-hmgR-mevK-pmk模块和pmd-idi-ads-ispA模块；

或两个模块的组合，hmgS-atoB-hmgR-mevK-pmk-pmd-idi模块和ads-ispA模块；

或一个整体模块hmgS-atoB-hmgR-mevK-pmd-pmd-idi-ads-ispA。

4.根据权利要求1和2所述的调控方法和调控组件包括不同的载体、启动子、5’非翻译区包括核糖体结合位点(RBS)或其组合。

5.根据权利要求1和2所述的工程菌的构造方法，其特征在于：所述载体为pBR322或p15A或pMB1或ColE1或pSC101或它们的变体。

6.根据权利要求1和2所述工程菌的构造方法，其特征在于：所述启动子为T7、TM1-TM255；所述5’非翻译区包括核糖体结合位点为5’URT-1-32。

7.通过采用两相同步萃取发酵或同步吸咐发酵的工艺来提高前体紫穗槐-4,11-二烯的产量以降低后续分离成本。

8.所述两相为其特征在于：

1)水相和有机相的组合，水相用于菌体生长和产物合成，有机相用于提取亲油产物紫穗槐-4,11-二烯；

2)或水相与固相的组合，水相用于菌体生长和产物合成，固相用于提取疏水产物紫穗槐-4,11-二烯。

9.根据权利要求8所述工艺，其特征在于：所述有机相如所述萃取剂为烷烃类、醇类、酯类或脂类的其中一种或者其组合，所述烷烃类包括癸烷、十一烷或十二烷等对菌体生长无明显抑制的烷烃，所述醇类包括癸醇或月桂醇及其他对菌体生长无明显抑制的醇类，所述酯类包括肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸甲酯、月桂酸甲酯等对菌体生长无明显抑制的酯类，所述脂类包括食用油如花生油、葵花籽油、大豆油、黄油或猪油等各种动植物提炼油。有机相的加入可以提高产物的产量和产率。

10.根据权利要求8所述工艺，其特征在于：所述固相如反相硅胶等其他可以选择性吸咐产物紫穗槐-4,11-二烯。反相硅胶不但可以吸咐产物还可以简化下游分离，从而有效降低生产成本。