[发明专利]实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法、引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种实时荧光定量PCR检测PD‑L1基因表达量的方法、引物及试剂盒，所述方法，包括如下步骤：(1)同步抽提样本中的DNA及mRNA；(2)以待测mRNA为模板，通过特殊的反转录引物合成第一链cDNA；(3)分别采用反转录引物上的特异序列所对应的引物及参照基因对应的特异性引物，以反转录产物cDNA及参照基因DNA为模板，进行双通道实时荧光定量PCR扩增，同时扩增目的基因cDNA与参照基因，并以参照基因和目的基因序列连接构建的质粒为标准品，根据各自的标准曲线，计算样本中目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的表达水平，本发明同步修正各种实验操作误差，保证了结果的可靠性和可重复性。

技术领域

本发明涉及对PD-L1基因表达量进行检测的方法。

背景技术

程序性细胞死亡因子配体1(processed death-1ligand 1，PD-L1)又称为B7-H1、CD274，是由CD274基因编码的一个抑制性共刺激分子。PD-L1属I型跨膜糖蛋白，有290个氨基酸，包括胞外区、疏水跨膜区和尾部胞浆区。PD-L1蛋白则广泛表达于淋巴细胞，如活化T和B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺内皮细胞等细胞以及心脏和胎盘等部位，同时也在多种肿瘤细胞及肿瘤微环境中的免疫细胞中高表达，如肺癌、食管癌、乳腺癌、淋巴瘤等，所述的PD-L1在文献：Dong,H.etal.(2002)NatMed 8,793-800、hompson,R.H.et al.(2006)Cancer Res 66,3381-5.和Pardoll,D.M.(2012)Nat Rev Cancer 12,252-64.中有详细的报道。

肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤躲避免疫系统清除的重要原因之一。表达于肿瘤细胞表面的PD-L1与PD-1结合抑制T细胞的激活，使其不能发现肿瘤。抗PD-L1单抗能有效结合肿瘤细胞表面的PD-L1，阻断信号通路，激活T细胞，并杀死肿瘤细胞。阻断PD-L1/PD-1通路能提高T细胞的反应。

研究发现，PD-L1在非肌层浸润性膀胱癌细胞表达水平与肿瘤病理分期相关，根据PD-L1的表达选择药物，可以提高治疗效果。下调肺腺癌A549细胞PD-L1的mRNA表达，可以增强杀伤细胞对A549细胞的杀伤作用。PD-L1蛋白是非小细胞肺癌中预测肿瘤术后进展的重要指标。PD-L1的预后指标作用在其他肿瘤的研究中也有相关报道。大量的研究表明，PD-L1可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的靶向治疗和预后诊断中发挥着重要的作用。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、机制明确、疗效显著、毒副作用少等优点，在各种疾病治疗、特别是对肿瘤治疗有非常广阔的前景。目前美国FDA已经批准使用的抗PD-L1的单抗药物为罗氏(Roche/Genentech)的Atezolizumab(Tecentriq)，在临床上用于治疗膀胱癌和非小细胞肺癌。

目前，临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验检测肿瘤组织内肿瘤细胞中PD-L1的表达状况，其实验方法的核心为特异性结合PD-L1的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性，而且其肉眼判断的主观性不可避免。因此，研制出一种灵敏度较高的特异性针对PD-L1蛋白表达的新型检测方法具有重要的意义。

传统RNA表达量检测方法，通常使用GAPDH、beta-actin、tubulin等mRNA作为参照，但由于不同组织部位参照基因表达量各不相同，以及细胞的生长状态不同引起的表达不稳定，同时通过实验验证，该标准并不能完全准确反应出待测基因表达量情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法和所用的引物，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明首先涉及一种以待检测的PD-L1mRNA为模板的反转录引物基因序列，SEQID NO:1，代号PD-L1RT；

SEQ ID NO:1：