[发明专利]一种猪支原体肺炎活疫苗黏膜免疫佐剂、制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种猪支原体肺炎活疫苗黏膜免疫佐剂、制备方法及其应用，涉及兽用疫苗领域。该黏膜佐剂是含有霍乱毒素B亚单位和猪肺炎支原体P97R1抗原融合表达的重组蛋白CTB‑P97R1的溶液。本发明还提供所述黏膜佐剂的制备方法，配制10mg/ml重组蛋白CTB‑P97R1母液，然后采用溶剂稀释。本发明还提供所述黏膜免疫佐剂在制备猪支原体肺炎活疫苗方面的应用。本发明黏膜佐剂为水性复方佐剂，制备方法简便，佐剂性质稳定，对猪肺炎支原体活力无损伤，可以和气溶胶保护剂兼容，且混合物对猪肺炎支原体活力依然无损伤，适合活疫苗气溶胶免疫，利用该佐剂可显著提高疫苗的黏膜免疫保护效力、延长免疫持续期。

技术领域

本发明涉及兽用疫苗领域，具体涉及一种猪支原体肺炎活疫苗黏膜免疫佐剂、制备方法及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪的慢性呼吸道传染性疾病，主要症状为咳嗽和气喘。主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻，发病率高、死亡率低。猪肺炎支原体感染后破坏纤毛，导致其他呼吸道细菌和病毒容易发生继发感染，从而造成更加严重的疫情。该病在世界范围内广泛流行，给现代养猪业造成重大经济损失。

猪支原体肺炎是一种顽固性慢性传染病，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，疫苗预防在控制猪支原体肺炎中起着关键性的作用。目前，国内外主要使用灭活疫苗进行预防，但由于猪肺炎支原体免疫原性弱，灭活疫苗保护效力往往不佳，仅能减轻症状不能阻断病原感染，且成本较高，并不能完全满足实际的需要。基因工程疫苗尚处于研究阶段，尚无产品上市。活疫苗能在体内短暂增殖，具有接种剂量小、免疫原性好、免疫效果持久的优势。

国内研究者(中国兽医药品监察所、江苏省农业科学院)在猪支原体肺炎活疫苗的开发上做了大量而有价值的工作，已研制的活疫苗免疫效力优于灭活疫苗，而成本相对较低，具有很强的市场竞争力。活疫苗通过呼吸道黏膜免疫后可以在支气管纤毛处黏附定植，形成占位效应，有效阻止临床野毒的感染，具有灭活疫苗和基因工程疫苗无法比拟的独特优势。但是，目前活疫苗采用肺内注射免疫途径，一定程度上影响了疫苗的广泛推广。气雾免疫、滴鼻免疫等，同样是通过呼吸道黏膜途径免疫，是非常有潜力的替代方式。黏膜免疫系统是机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线，但目前通过黏膜免疫的疫苗却相对较少，很大程度上与黏膜部位的生理特点趋向于产生免疫耐受有关。为进一步增强活疫苗的黏膜免疫刺激能力，向疫苗中添加适合黏膜免疫的佐剂是有效手段。

现有技术中，还没有有效的针对猪支原体肺炎活疫苗的黏膜佐剂。究其原因，主要存在以下困难：第一，目前对黏膜免疫佐剂的研究尚十分缺乏，很大程度上受到黏膜免疫应答研究不清晰的影响，绝大多数佐剂成分在黏膜部位的使用效果、作用原理均不清楚，给佐剂选择带来了相当的困难。需根据猪肺炎支原体免疫需求，利用动物试验对可有效激活局部黏膜免疫和细胞免疫的佐剂成分进行筛选；第二，对细菌类活疫苗而言，在佐剂选择方面亦具有特定的要求，由于油类物质对细胞膜的破坏性，油包水类佐剂往往不适用，而即便是水包油类和双相佐剂对其稳定性和制备工艺的要求也很高，可优先考虑采用水性佐剂，利用体外兼容性试验来进行筛选；第三，猪支原体肺炎活疫苗进行气溶胶免疫时需要加入喷雾保护剂，保证在雾化过程中活疫苗的活性，但喷雾保护剂一般为特殊高分子成分,部分佐剂由于本身化学性质、所用溶剂、离子浓度、pH等原因不能与喷雾保护剂配合使用(包括两者混合后理化性质不稳定、混合物对支原体活力有损伤、混合物不能发挥原有的喷雾保护效果、混合物不能发挥原有的佐剂活性)，因此所选择的佐剂必须通过一系列试验证明其能与喷雾保护剂配合使用，才能满足猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的使用需求。

发明内容

本发明的主要目的在于公开一种对猪支原体肺炎活疫苗活力无损伤的、可与气溶胶喷雾保护剂配合使用的、能增强黏膜途径免疫刺激能力的、并能强化重要保护性抗原P97R1免疫应答的猪支原体肺炎活疫苗的黏膜免疫佐剂。

本发明的另一个目的是提供上述黏膜免疫佐剂的制备方法，该方法简单高效。

本发明的再一目的是提供上述黏膜免疫佐剂的应用。