[发明专利]一种猪支原体肺炎活疫苗黏膜免疫佐剂、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种猪支原体肺炎活疫苗的免疫佐剂与保护剂的混合物，其特征在于所述混合物包括黏膜免疫佐剂和喷雾保护剂；所述黏膜佐剂是含有霍乱毒素B亚单位和猪肺炎支原体P97R1抗原的融合蛋白CTB-P97R1的溶液，所述佐剂含有0 .2-2 mg/ml融合蛋白CTB-P97R1、150-300μg/ml Poly（I:C）和50-150μg/ml皂苷，所述融合蛋白CTB-P97R1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述喷雾保护剂是含聚乙二醇6000 35-45g/L、环糊精3-5 g/L、硫代硫酸钠18-22 g/L和L-组氨酸18-22g/L的水溶液，pH 为7.0-7.5。

2.根据权利要求1所述混合物，其特征在于所述融合蛋白CTB-P97R1采用如下方法制备：将猪肺炎支原体黏附因子P97的R1区基因融合至霍乱毒素B亚单位基因的C端，装入pET-28a(+)质粒中构建重组质粒pET28a-CTB-P97R1；将该重组质粒导入大肠杆菌，获得重组菌；采用IPTG诱导重组菌表达CTB-P97R1，收集菌体裂解液上清，纯化，得到融合蛋白CTB-P97R1。

3.根据权利要求2所述混合物，其特征在于所述的皂苷为皂树皂苷、人参皂苷或三七皂苷。

4.权利要求1所述混合物的制备方法，其特征在于采用磷酸盐缓冲液配制10mg/ml融合蛋白CTB-P97R1母液；配制1mg/ml的Poly（I:C）母液和1mg/ml皂苷母液，溶剂均为磷酸盐缓冲液；将所述融合蛋白CTB-P97R1母液、Poly（I:C）母液和、皂苷母液混合后，采用溶剂稀释，得到猪支原体肺炎活疫苗黏膜佐剂。

5.权利要求1所述混合物在制备猪支原体肺炎活疫苗方面的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于将所述黏膜佐剂与喷雾保护剂按照体积比为1:1混合，然后加入猪肺炎支原体疫苗株培养物或者冻干粉，混合均匀，得到猪支原体肺炎活疫苗溶液。