[发明专利]一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法

权利要求书

1.一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括如下9对通用性EST-SSR引物：

（1） LYP1-42正向引物和LYP1-42反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

（2）LYP2-8正向引物和LYP2-8反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

（3） LYP2-11正向引物和LYP2-11反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；

（4） LYP2-23正向引物和LYP2-23反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；

（5） LYP3-22正向引物和LYP3-22反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示；

（6） LYP4-3正向引物和LYP4-3反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；

（7）LYP4-19正向引物和LYP4-19反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示；

（8）LYP4-22正向引物和LYP4-22反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示；

（9） LYP5-8正向引物和LYP5-8反向引物，寡核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18所示。

2.一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基因组DNA提取：提取无患子科中龙眼属、无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属共5个属种质材料的基因组DNA；

（2）PCR扩增：以基因组DNA为模板，使用如权利要求1所述的9对通用性EST-SSR引物进行PCR扩增；

（3）凝胶电泳：对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（4）数据统计：读取图谱条带，建立0/1数据矩阵，计算遗传相似系数，进行聚类分析。

3.根据权利要求2所述的一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

（1）基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取无患子科中龙眼属、无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属共5个属种质材料的基因组DNA；采用1wt%的琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计检测所提取基因组DNA的质量和浓度；稀释DNA浓度至25 ng/μL，-20 ℃保存备用；

（2）PCR扩增：以5个属种质材料的基因组DNA为模板，使用如权利要求1所述的9对通用性EST-SSR引物进行PCR扩增；

PCR反应体系：PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L正、反向通用性EST-SSR引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH₂O 2 μL，总体积10 μL；

PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，53或55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50s，30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存；其中通用性引物LYP1-42和LYP3-22的退火温度53℃；LYP2-8、LYP2-11、LYP2-23、LYP4-3、LYP4-19、LYP4-22和LYP5-8的退火温度55 ℃；

（3）凝胶电泳：PCR扩增产物在6wt%聚丙烯酰胺凝胶上120 V，90~120 min恒压电泳，用GeneGreen核酸染料染色15 min，最后在凝胶成像系统上拍照记录；对于条带模糊的植株样本，进行PCR及电泳的3次重复验证；

（4）数据统计：对EST-SSR图谱中扩增清晰且易于辨认的条带进行统计，在相同的迁移位置上有带标记为1，无带标记为0，建立0/1数据矩阵；计算Dice遗传相似系数，UPGMA方法聚类；根据遗传距离和聚类分析的结果鉴定区分龙眼属及其近缘属植物。