[发明专利]一种测定生物基质中海藻糖浓度的方法

说明书

本发明一种测定生物基质中海藻糖浓度的方法，基于液相色谱质谱法结合柱后泵入辅助试剂实现浓度测定。包括步骤：预制待测样品、通过蛋白沉淀法对定量吸取的生物基质进行前处理，去除干扰海藻糖含量测定的蛋白质沉淀；定量分析、将前处理后所得的待测样品转移至色谱柱，通过柱后泵入辅助试剂在质谱仪中进行液相色谱质谱分析，得到每毫升纳克级的浓度结果。应用本发明海藻糖浓度的测定方法，通过改良液相色谱质谱分析过程实现了将海藻糖定量测定的定量下限从微克/毫升级别降至20纳克/毫升，显著提高了灵敏度，并采用简单快速的蛋白沉淀进行前处理，明显简化处理步骤，缩短处理时间，提高了分析速率。

技术领域

本发明涉及一种海藻糖的分析方法，尤其涉及一种高精度定量测量生物基质中海藻糖浓度的方法。

背景技术

海藻糖，一种由两个葡萄糖分子结合而成的非还原性二糖。经研究发现海藻糖作为一种应激代谢物能在一些恶劣环境条件下如干燥失水、寒冷、高温等对生物体或一些活性分子进行有效保护，这些独特的生物学特性使其在医药、食品、化妆品和农业等方面具有广阔的应用前景。有关海藻糖制备及其在生物体内代谢机理等研究的论文很多，而且随着研究的深入，对海藻糖含量测定是一个基本前提，灵敏快速的测定方法是研究的分析准确性与结果可靠性的保证并大大加快研究速度。

目前海藻糖含量或浓度的多种分析方法中相比于高效液相色谱（HPLC）法，采用气相色谱法的缺点在于操作繁琐、干扰大，层析法的缺点在于灵敏度低，而酶分析法的缺点在于灵敏度虽高但同样操作过于复杂，成本也很高。综合比较得知，高效液相色谱法显然更值得优选。尽管如此，从目前最优选的分析方法看HPLC法的定量下限为微克/毫升的灵敏度级别，依然无法满足分析低浓度样品的需求，无法为海藻糖的深入研究提供全面可靠保障。

发明内容

本发明的目的旨在提出一种测定生物基质中海藻糖浓度的方法，以此解决海藻糖加速并深入研究的助益问题。

本发明实现上述目的的技术解决方案是，一种测定生物基质中海藻糖浓度的方法，其特征在于：所述方法基于液相色谱质谱法结合柱后泵入辅助试剂实现浓度测定。

进一步地，该测定方法包括步骤：预制待测样品、通过蛋白沉淀法对定量吸取的生物基质进行前处理，去除干扰海藻糖含量测定的蛋白质沉淀；定量分析、将前处理后所得的待测样品转移至色谱柱，通过柱后泵入辅助试剂在质谱仪中进行液相色谱质谱分析，得到每毫升纳克级的浓度结果。

更进一步地，所述前处理步骤为：先将生物基质转移至处理容器，使用相对生物基质4倍样品体积的乙腈涡旋混匀、并作离心处理，得到作为待测样品的上清液和作为干扰物的底部沉淀物。

再进一步地，所述离心处理的转速介于3200-4000转/分钟，离心时间介于5-20分钟。

更进一步地，所述前处理步骤中在生物基质中加入20%样品体积的内标甲醇溶液。

进一步地，定量分析中，柱后泵入的所述辅助试剂为含5%氨水的乙腈溶液，且泵入辅助试剂的流速为0.1ml/分钟。

进一步地，所述液相色谱质谱分析中第一流动相为去离子水，第二流动相为乙腈，且两流动相由各自的泵驱动汇入色谱柱前的进样器。

进一步地，定量分析中所用质谱仪的型号条件为Sciex 4000或更高型号。

应用本发明海藻糖浓度的测定方法，具备突出的实质性特点和显著的进步性：该方法通过改良液相色谱质谱分析过程实现了将海藻糖定量测定的定量下限从微克/毫升级别降至20纳克/毫升，显著提高了灵敏度，并采用简单快速的蛋白沉淀进行前处理，明显简化处理步骤，缩短处理时间，提高了分析速率。

附图说明

图1是测定生物基质中海藻糖浓度的仪器系统图。

具体实施方式