[发明专利]一种利用甲醛还原NAD类似物的方法

说明书

本发明公开了一种利用甲醛还原NAD类似物的方法及其应用。该方法以甲醛脱氢酶为催化剂，以NAD类似物为电子受体，将甲醛特异性氧化成甲酸，起到解毒作用，同时将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态的NAD类似物，为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原力，应用于苹果酸酶ME‑L310R/Q401C、D‑乳酸脱氢酶DLDH‑V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该方法也可在胞内或胞外的复杂反应体系中以NAD类似物为电子受体，以甲醛脱氢酶为催化剂特异性氧化甲醛，实现解毒作用，同时不干扰体系中其他反应的正常进行。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物的酶催化还原方法及其应用，具体地说，是以NAD类似物为电子受体，在酶催化下将甲醛特异性氧化成低毒性的甲酸，同时生成的还原态NAD类似物可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程。由于NADH可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行特异性调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Wang L,et al.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。

甲醛具有强还原性，能与DNA、RNA和蛋白质的亲核基团形成交联结构从而造成蛋白或核酸损伤(Woolston BM,et al.Biotechnol Bioeng,2018,115,206-215)。而甲醛的下游产物甲酸相对甲醛来说对细胞的毒性较小，利用甲醛脱氢酶对NAD类似物还原的同时能实现对甲醛的解毒作用。以NAD为辅酶将甲醛氧化为甲酸的酶分为两类，第一类甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.1)依赖于谷胱甘肽，在甲醛和谷胱甘肽存在时，能自发生成甲醛脱氢酶的底物S-羟甲基谷胱甘肽，经甲醛脱氢酶催化生成的S-甲酰基谷胱甘肽被S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EC 3.1.2.12)不可逆地水解为谷胱甘肽和甲酸(BARBER RD,et al.J Bacteriol,1996,178,1386-1393)。第二类甲醛脱氢酶能直接利用甲醛和NAD⁺，生成甲酸和NADH。来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶是已鉴定的仅有的不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶，催化甲醛的不可逆氧化(Zhang W,et al.Protein Expres Purif,2013,92,208-213；ITO K,et al.J Bacteriol,1994,176,2483-2491)。采用不依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶可使反应简单化，使甲醛直接、不可逆地转化成甲酸，同时将还原力储存在NADH中，因此来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的甲醛脱氢酶pFADH和来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的甲醛脱氢酶aFADH在NAD类似物的还原和甲醛直接氧化的生物正交解毒体系中占有绝对优势。