[发明专利]一种利用甲醛还原NAD类似物的方法

权利要求书

1.一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：以NAD类似物为介导物，在可利用甲醛的酶催化下，以甲醛为还原剂，在pH 5-8的缓冲体系中，10-40℃下，反应2-120min，获得甲醛氧化产物甲酸，同时获得还原型NAD类似物；所述可利用甲醛的酶为经过基因工程改造的甲醛脱氢酶突变体，其中甲醛脱氢酶来源于Pseudomonas putida的pFADH或来源于Pseudomonasaeruginosa的aFADH，其中甲醛脱氢酶突变体为pFADH-A192S，pFADH-A192S/A261N，pFADH-A192T/R267N，pFADH-P220C，pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L，aFADH-V219K/G264S，aFADH-V283I/V219R，aFADH-G298V或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上；所还原的NAD类似物为NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD中的一种或两种以上，它们的化学结构如下：

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述可利用甲醛的酶以甲醛为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述还原剂为甲醛、氘代甲醛中的一种或两种的任意比组合。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：当所用NAD类似物为NCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S，aFADH-H270S或aFADH-G264S/A267L中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NFCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L或aFADH-V219K/G264S中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NClCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192T/R267N，pFADH-P220C或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NBrCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为aFADH-V219K/G264S，aFADH-V283I/V219R或aFADH-G298V中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NMeCD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为aFADH-H270S，aFADH-G264S/A267L或aFADH-V283I/V219中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NUD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V283I/V219R中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NTD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V263S/E266C中的一种或两种以上；当所用NAD类似物为NGD时，可利用甲醛的甲醛脱氢酶为pFADH-A192S/R267Q/V282K，aFADH-H270S，aFADH-V219K/G264S或aFADH-V283I/V219R中的一种或两种以上。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征还在于：所述还原剂的氧化产物为甲酸、氘代甲酸的一种或两种的任意比组合。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：缓冲体系中甲醛脱氢酶的终浓度为4μg/mL-1500μg/mL、NAD类似物的终浓度为0.01mM-20mM、甲醛的终浓度为0.4mM-100mM；所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液或PIPES缓冲液中的一种或两种以上。