[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸菌株的诱变选育方法

说明书

本发明公开了一种通过二次诱变选育高产γ‑氨基丁酸(γ‑aminobutyric acid，GABA)的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的方法，包括短乳杆菌的常压室温等离子体诱变(ARTP)和高产菌株的筛选方法。本发明的特征是在前期经过多功能等离子体诱变系统(MPMS)(载体为氮气)诱变获得的高产菌种的基础上，通过ARTP(载体为氦气)再次进行诱变获得更高的γ‑氨基丁酸产量，并对此高产菌株进行了5L发酵罐放大实验，证明了二次ARTP的诱变方法，可以使菌株的目的产物的产量更高。本发明中菌株诱变方法比常规诱变方法效率高，筛选过程简单迅速，得到的诱变菌株γ‑氨基丁酸产量更高，得到的突变株最终产量为115.72g/L，比出发菌株提高9.80％，摩尔转化率为93.95％，比出发菌株提高3.93％，为产业化的提高提供了坚实的理论基础和数据参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及ARTP诱变技术，是一种高产γ-氨基丁酸菌株的诱变选育方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种普遍存在于动植物和微生物体内的非蛋白质天然氨基酸。在哺乳动物体内GABA几乎只作用于神经系统，是中枢神经系统内最重要的抑制性氨基酸递质，大约有30％的中枢神经突触以它为介质。GABA具有多种生理功能，主要有调节血压与心率、改善肝脏、肾脏功能、抗衰老、调节激素分泌等，因此，它既可以作为一种药效良好的药物，又可以被视为具有保健功能的新型功能因子，广泛应用于食品和医疗卫生行业。

GABA的制备方法主要有三种，它们各有优缺点，分别是化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。化学合成法成本高，副反应多，环境污染严重；植物富集发产量太低，不适合工业化生产；而微生物发酵法成本低，安全性高，环保，具有很好的开发前景，因此成为GABA生产的首选方法。微生物发酵法是以L-谷氨酸(L-Glu)或者其钠盐，还包括富含谷氨酸的其他物质为原料，利用微生物体内的谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)将原料转化产生GABA。在早期的研究中，发酵法生产GABA以大肠杆菌为生产菌，然而若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的种种问题。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)被美国FDA认为是“GRAS(generally recognized as safe)”级食品添加剂，而短乳杆菌早已被证实具有合成GABA的能力，但是菌株的产量一直限制GABA的发酵生产，因此获得一株高产GABA的菌株尤为重要。

常压室温等离子体诱变系统(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)，能够在大气压下产生一些高活性粒子浓度的等离子体射流，温度在25～40℃之间，高浓度活性粒子能够作用于微生物的遗传物质，使其在短时间内产生突变。由于其设备简单，操作简易，能够在短时间内获得大量突变菌株，因此已成为获得高得率菌株的有效方法。本文以在MPMS诱变系统诱变短乳杆菌(Lactobacillus brevis)TCCC 13007的基础上，利用ARTP诱变系统进行再次诱变，筛选得到一株GABA产率高的突变株，为GABA的工业化生产提供了获得优良菌种的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，在本发明人前期利用MPMS诱变短乳杆菌获得的GABA高产菌株的基础上再次进行ARTP诱变，获得更高的GABA产量。

本发明的另一个目的是提供一种利用等离子体处理短乳杆菌的方法以及高通量筛选高产菌株的方法

本发明的另一个目的是公开了采用短乳杆菌作为菌种使用发酵罐生产GABA的方法，它是在培养过程中分为两个不同的阶段，即细胞生长和转化，进而采取控制不同的pH和通氧量，并且补充底物谷氨酸钠，进而使产量达到最高。

本发明的技术方案如下：一种使用ARTP诱变筛选高产GABA的短乳杆菌突变株的方法，包括如下步骤：