[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸菌株的诱变选育方法

权利要求书

1.一种利用常压室温等离子体制备高产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)菌体前培养；

(2)菌悬液的制备；

(3)利用常压室温等离子体(ARTP)诱变系统对短乳杆菌进行诱变，将诱变后的菌株悬浮液进行稀释后，进行平板计数，确定致死率随诱变时间的变化数值关系；

(4)以适当时间诱变后，将得到的菌液涂布于碳酸钙筛选培养基上，在正常条件下进行培养，同时以未处理的菌液为对照；

(5)待诱变菌落长出后观察透明圈大小，挑取菌落小透明圈大的很可能为高产GABA的菌株进行初筛；缩小筛选范围后，进行试管发酵和摇瓶发酵复筛，进一步筛选GABA高产菌株；

(6)将复筛所得诱变株连续10代传代培养，测定突变株的遗传稳定性；

(7)在对筛选得到的突变株进行摇瓶发酵验证后，利用5L发酵罐进行小规模放大培养生产GABA，验证高产菌株的产量。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(1)中菌体前培养为：从平板挑取一环活化后的菌种接于液体种子培养基中，30℃静置培养8～10h，使菌体处于对数生长期，其中的种子培养基为：蛋白胨5～15g/L，酵母浸粉2～10g/L，葡萄糖5～15g/L，乙酸钠1～5g/L，柠檬酸铵1～5g/L，硫酸锰0.01～0.05g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，吐温-80 1～5mL，pH自然。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(2)中菌悬液的制备为：取1mL对数生长期菌液测其OD_600nm值，根据OD_600nm值与菌落数的大体关系估算菌体浓度，取1mL菌液12000r/min离心2min，收集菌体并用无菌生理盐水洗涤2～3次，将其稀释至10⁶CFU/mL的菌悬液。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(3)中利用常压室温等离子体(ARTP)诱变系统的参数设定为：输出功率120W，照射距离2mm，气体流速10L·min^-1，样品量10μL，通入气体为氦气，处理时间分别为0s、10s、30s、50s、70s、90s、110s。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(4)中：以处理时间为90s利用ARTP进行诱变，将诱变过的载片置于装有1mL无菌生理盐水的1mL离心管中，用漩涡振荡仪进行振荡洗脱，制成菌悬液，稀释到1×10^-4梯度后，取100μL均匀涂到碳酸钙筛选培养基表面，30℃培养1d，挑选透明圈/菌落直径比较大的菌株，其中碳酸钙筛选培养基为：葡萄糖5～15g/L，酵母浸粉5～20g/L，蛋白胨2～10g/L，硫酸铵1～5g/L，氯化钠0.1～0.5g/L，硫酸亚铁0.01～0.1g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，碳酸钙1～10g/L，谷氨酸钠10～100g/L，琼脂15～20g/L，pH自然。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(5)中将通过筛选平板得到的菌株通过试管发酵进一步筛选，在30℃静置培养发酵72h后，通过高效液相色谱(highperformance liquid chromatography，HPLC)仪进行GABA产量检测，将得到的高产菌株进行摇瓶发酵复筛，在30℃静置培养发酵12h后补加80～150g/L谷氨酸钠，继续发酵60h。其中发酵培养基为蔗糖10～50g/L，酵母浸粉20～50g/L，谷氨酸钠10～100g/L，乙酸钠1～10g/L，磷酸氢二钾1～10g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸铵0.1～0.5g/L，柠檬酸1～10g/L，精氨酸0.01～0.1g/L，硫酸锌0.1～1g/L，维生素B1 1～10mg/L，维生素B5 1～10mg/L，维生素B61～10mg/L，pH4.5。