[发明专利]一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法

说明书

本发明公开了一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，该分析方法步骤如下：首先对将细菌样品进行淬灭，分别设置了设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组；对淬灭后的细菌样品进行代谢物的提取；未衍生化的提取物进行液质联用质谱(LC‑TOF/MS)检测，原始数据使用使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘‑判别分析(PLS‑DA)，得到具有显著差异的代谢物；将衍生化后的提取物进行气质联用质谱(GC‑TOF/MS)检测，使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘‑判别分析(PLS‑DA)，得到具有显著差异的代谢物。本发明无需复杂的样品处理过程、灵敏度高、准确度高的特点，可作为一种有效的方法用于判断受污染食品中肉毒杆菌的具体血清型。

技术领域

本发明涉及非靶向代谢组学分析、质谱相对定量分析领域，具体涉及一种基于质谱检测的一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法。

背景技术

不同血清型的肉毒杆菌在基因组上十分相似，仅在毒力因子上有所不同，因此在血清型分析上十分困难。对污染食品的肉毒杆菌进行分型的方法，主要是依据基因测序和免疫学实验等生物学方法，这些生物学方法实验过程复杂，且容易受到实验中各种因素的干扰影响检测结果的准确性。代谢组学技术通过核磁共振、液质联用、气质联用等技术，能够对生物体的代谢物进行采集分析，从而观测生物体代谢水平整体的动态变化。目前，代谢组学技术应用广泛，对样品进行简单处理后，使用到的液质联用技术对极性、不易挥发的物质进行分析，气质联用技术对非极性、热稳定的物质进行分析，两种方法结合起来对生物体的代谢物进行完整的分析。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的对细菌分型的生物学方法，其对实验过程复杂，且容易受到实验中各种因素的干扰，无法进行准确的判断等问题，提供一种有效的方法，能够作为对污染食品的肉毒杆菌进行分型的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：对肉毒杆菌提取物进行质谱检测，通过代谢组学分析得到差异代谢物，从而对不同细菌血清型分型的方法。

一种基于质谱检测的对细菌不同血清型分型的方法包括以下步骤：

1)设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，将细菌样品进行淬灭；

2)对步骤1)淬灭后的样品进行提取；

3)用步骤2)得到的样品进行液质联用质谱(LC-TOF/MS)检测，原始数据使用使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；

4)用步骤2)得到的样品进行衍生化；

5)将步骤4)得到的样品进行气质联用质谱(GC-TOF/MS)检测，使用仪器自带软件对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；

步骤(1)所述淬灭实验：将液体培养基中的细菌样品与经-80℃预冷的60％甲醇-水溶液等体积混匀，随后在-9℃，3000g条件下离心9min，快速弃去上清。

步骤(2)所述提取实验：将淬灭得到的沉淀重悬于500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS 检测的样品使用90％甲醇-水溶液)中，在液氮中冷冻，干冰中融解，重复三次冻融，随后在 -9℃，16000g条件下离心5min，上清存储于干冰内。在沉淀中再次加入500μL经-80℃预冷的 100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)，重复上面的步骤，将两次的上清收集到一起。