[发明专利]一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法

权利要求书

1.一种基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：

具体包括如下步骤：

1)设置大肠杆菌/载入A型肉毒毒素基因的大肠杆菌组、A型肉毒杆菌/B型肉毒杆菌的肉毒杆菌组，将细菌样品进行淬灭；

2)对步骤1)淬灭后的样品进行提取；

3)用步骤2)得到的样品进行液质联用质谱(LC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用MetaboAnalyst软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物；

4)将步骤2)得到的样品进行衍生化，然后进行气质联用质谱(GC-TOF/MS)检测，对原始数据进行处理后，使用Simca13.0软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)，得到具有显著差异的代谢物。

2.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(1)所述淬灭实验：将液体培养基中的细菌样品与经-80℃预冷的60％甲醇-水溶液等体积混匀，随后在-9℃，3000g条件下离心9min，快速弃去上清。

3.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(2)所述提取实验：将淬灭得到的沉淀重悬于500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)中，在液氮中冷冻，干冰中融解，重复三次冻融，随后在-9℃，16000g条件下离心5min，上清存储于干冰内。在沉淀中再次加入500μL经-80℃预冷的100％甲醇(LC-MS检测的样品使用90％甲醇-水溶液)，重复上面的步骤，将两次的上清收集到一起。

4.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(3)所述LC-TOF/MS条件为：流动相：0.1％甲酸-水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液；色谱柱：C18分析柱(2.1×100mm，1.8μm)；离子源：ESI源，3kV；锥孔电压：100V；电离源温度：120℃；质量扫描范围：100-1500Da；扫描时间：0.1s。

5.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(4)所述衍生化：将步骤(2)得到的提取物进行氮气吹干，干燥后的提取物与40μL20mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，涡旋，充分混匀，在30℃下，以130rpm转速孵育90min；充分反应后，再加入40μL MSTFA(含1％TMCS)，充分混匀后，在37℃下气浴30min，取出后，在室温下放置120min，终体积为80μL。

6.根据权利要求1所述的基于质谱检测的对肉毒杆菌不同血清型分型的方法，其特征在于：步骤(5)所述GC-TOF/MS条件为：离子源：EI源，70eV；溶剂延迟：330s；质量扫描范围：50-800Da；采集电压：1550V；采集速度：10Spectra/s；进样口、传输线和离子源温度分别为：250℃、250℃及220℃。

7.基于质谱检测的蛋白质消化稳定性分析方法的应用，其特征在于：所述质谱检测对细菌进行分型的方法具有样品处理简单、灵敏度高、准确度高的特点，可作为一种有效的方法用于判断受污染食品中肉毒杆菌的具体血清型。