[发明专利]一种实验室的微生物污染鉴别方法

说明书

本发明公开了一种实验室的微生物污染鉴别方法，其中，所述鉴别方法采用巢式PCR对实验室微生物16S rRNA进行高通量测序，测序结果与微生物对照表进行对比，无重叠的微生物判断为污染物。本发明采用以实验室微生物污染物作为研究对象，基于生物信息学思路和高通量测序技术，结合生物信息学方法定性和定量分析可能的污染物并推测污染源头，提供一种普适性的鉴定方法，具有检测周期短，检测通量高，准确性高、灵敏度高、指导性强、针对性强，通用性好的特点。

技术领域

本发明涉及一种实验室的微生物污染鉴别方法，属于微生物多样性研究领域。

背景技术

一般情况下，一个人从出生到死亡，大部分的时间都是在室内环境中度过的(Kelley,S.T.and J.A.Gilbert,2013.)。因此，全面了解室内环境中复杂的微生物分布情况、形成的原因和可能的影响十分必要。随着人们对环境微生物的深入研究，其对人类健康的影响已得到广泛的认知(O'Hara,N.B.,et al.,2017,Coombs,K.,et al.,2018,Jayaprakash,B.,et al.,2017,Tong,X.,et al.,2017.)。目前已有许多研究对各种室内环境(如家庭住宅、交通环境、办公室、医疗保健场所等)的微生物多样性进行了评估，发现其微生物多样性与所处的地理位置、天气状况、人口密度、功能用途、内部通风等情况息息相关(O'Hara,N.B.,et al.,2017,Proctor,C.R.,et al.,2017.)。然而，对于众多研究者而言，他们自身所处的实验室，却仍然是一个尚未被探索的领域。

微生物污染广泛存在于分子生物学实验室(Salter,S.J.,et al.,2014.)，每个实验室通常会对特定类型的样品(如动物、植物或微生物等)进行实验，则在一定程度上存在微生物污染情况。因此，需要对实验室的微生物群落进行特征化，来衡量实验室污染情况。据此，在进行分子生物学实验前对已知的污染物进行抗微生物操作，进而降低实验过程中的污染概率和微生物污染物对实验本身和操作人员的影响。实验室对环境和空气质量的要求较高，定期的微生物清理和微生物群落鉴定都是实验室中日常维护的重要一环。但由于微生物流动性大且种群数量多，常规的鉴定方法难以在实验室条件下培养微生物菌落进行鉴定，因此，针对难以甚至不可在实验室条件下培养的微生物群落，宏基因组方法是一种必不可少的研究手段。

宏基因组研究常用的办法是使用细菌，古菌和真菌的特异性引物进行系统发育标记分子(如16S rRNA)的扩增，并测定其序列信息，以此来确定样本中微生物群落的物种组成，并判断每一物种在该样本中的相对丰度。宏基因组测序(包括二代测序和三代测序)和16S rRNA技术的联合使用，既可以得到样本中微生物群落的物种组成情况，还可以在基因水平和其相应的功能程度上对群落中的微生物进行对比分析。

目前，研究微生物多样性的最常用的分子方法是直接对编码小亚基核糖体RNA(16S rRNA)的基因进行多聚酶链式反应扩增和测序，直接从样本中的所有微生物细胞中提取基因组，并使用从16S rRNA基因保守区设计的“通用”PCR引物从样本中的所有微生物基因组中扩增出该基因。相比用培养基培养菌落来确定样本中微生物种类的方法，该方法很容易确定微生物的多样性，可以发现不能用培养确定的微生物。但此方法存在两个明显的缺点：不同的DNA提取技术，对混合不均匀的细胞进行裂解时，微生物多样性不同；不存在真正通用的PCR引物，即使是最全面的一对，也只能覆盖大约85％的已知分类群。因此，该技术需与严格实验设计一起使用。

实验室急需准确有效的微生物鉴别方法，但目前由于缺乏筛选出污染物的分析方法，还没有比较完善的实验室微生物污染评估体系。因此非常有必要运用生物信息学的方法定性和定量分析高通量测序获得微生物宏基因组测序数据，鉴定微生物污染物并推测污染源头，从而揭示它们可能对身体产生的影响。