[发明专利]柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括总核酸提取试剂，引物EL4‑F4、EL4‑R4，GoTaq qPCR MasterMix，所述引物序列为：EL4‑F4：5′‑CTACAGGGACAGGTTTATTG‑3′，EL4‑R4：5′‑ACAGACCCACCGTCCTCA‑3′。还一种柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：(1)取待测植株组织，抽提总核酸；(2)以提取的总核酸为模板，利用前述的检测试剂盒进行qPCR检测。本发明方法操作简便、特异性强且重复性好，与常规PCR法相比，其灵敏度提高了100倍，检测的“窗口期”缩短了2个月。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

柑橘褪绿矮缩病是一种由柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associatedvirus，CCDaV)引起的新发危险性病害，可侵染大多数的柑桔种，引起植株叶片变形、扭曲、花叶等症状，造成果实变小，产量降低。CCDaV最早于上世纪80年代发现于土耳其，目前已成为在土耳其为害最严重的柑桔病毒类病害。近年在中国云南也有CCDaV发生的报道。CCDaV为双生病毒科(Geminiviridae)成员，主要通过嫁接和杨梅粉虱(Parabemisiamyricae)传播。

目前尚无CCDaV的有效防治药剂，准确、灵敏、快速的检测方法是柑橘安全生产和建立无病毒苗木繁殖体系的前提和保障。实时荧光定量PCR(qPCR)法具有快速、灵敏和准确的特点，能对未知样品进行定量分析。由于CCDaV是近年来新发病害，目前对于还缺少一套低成本、快速、灵敏、准确的检测方法。

发明内容

针对我国现CCDaV检测技术不足的问题，本发明提供了一种准确度高、特异性强、灵敏度高的柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法。

本发明实现其目的采用的技术方案是：

一种柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括总核酸提取试剂，引物EL4-F4、EL4-R4，GoTaq qPCR MasterMix，所述引物序列为：

EL4-F4：5′-CTACAGGGACAGGTTTATTG-3′，

EL4-R4：5′-ACAGACCCACCGTCCTCA-3′。

一种柑橘褪绿矮缩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)取待测植株组织，抽提总核酸；

(2)以提取的总核酸为模板，利用上述的检测试剂盒进行qPCR检测。

qPCR的20μL反应体系包含：模板2μL、GoTaq qPCR MasterMix 10μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL，超纯水7.2μL。

qPCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火30s，72℃延伸30s，40个循环；扩增后采集熔解曲线程序：95℃变性15s后，从60℃开始，每升高0.5℃停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95℃融解曲线采集完成。

本发明的有益效果是：本发明所建立的CCDaV qPCR检测方法操作简便、特异性强且重复性好，与常规PCR法相比，其灵敏度提高了100倍，检测的“窗口期”缩短了2个月，更适用于低浓度CCDaV样品的检测。虽然目前CCDaV在田间的发生率不高，但是杨梅粉虱在中国分布广泛，因此加强CCDaV的监测十分重要，本发明方法灵敏度高、特异性强、能快速检测到极低含量的病毒，为柑桔褪绿矮化病的大规模检测、预测预报、病害流行监控，早期CCDaV的检控等，以及无病毒苗木生产提供了重要的技术支撑；争取从源头和传播途径上控制该病的传播和流行，从而保障柑橘产业的可持续发展和进出口贸易安全。