[发明专利]一种乳酸菌素plnE及其制备方法

说明书

本发明涉及一种乳酸菌素plnE及其制备方法，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与现有技术相比，本发明利用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，具有分子量小、人工合成方便且活性高等特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌具有很强的杀菌作用，在断奶仔猪饲料中应用可以促进断奶仔猪的肠道健康和提高免疫功能。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种乳酸菌素plnE及其制备方法。

背景技术

随着抗生素的大量使用甚至滥用，它也随之产生了很多的不良影响，如引起动物菌群失衡、产生耐药性、危害人类健康等。因此，研究可以改善畜禽健康、提高生长性能且安全无毒的能替代抗生素的添加剂具有重要的意义。乳酸菌素指的是部分乳酸菌在其代谢过程中，可以通过核糖体合成而产生的能够抑菌的蛋白。乳酸菌素具有无毒、无副作用、无残留，耐低温贮藏，热稳定性等优点，可以选择性的杀死一些致病菌，并可以保护和促进机体益生菌的生长，从而调节机体的免疫功能，在动物生产上可以作为饲料添加剂被应用。过去大多都是采用硫酸铵沉淀、乙酸乙酯等方法提纯乳酸菌素，然而得到的乳酸菌素的产量有限且活性不高。

专利CN106191044A公开了一种提高乳酸菌素plnK产量的基因工程方法，专利CN107043769A公开了一种提高乳酸菌素plnJ的产量的基因工程，这两篇专利制备得到了乳酸菌素plnK和plnJ，但在应用中发现，这两种乳酸菌素虽然也有抑菌效果，但抑菌所需的量较大，即抑菌所需的成本较高。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种产量高、活性好的乳酸菌素plnE及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种乳酸菌素plnE，该乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述乳酸菌素plnE的分子量为6.2KDa。该乳酸菌素plnE的等电点为11.7。

一种如上所述乳酸菌素plnE的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成plnE上游引物F和plnE下游引物R，其中，plnE上游引物F为5’-CGCGGATCCATGCTACAGTTTGAGAAGTT-3’，plnE下游引物R为5’-CGGAATTCTTAACGAATACTTTTCAAAA-3’；

(2)以plnE上游引物F和plnE下游引物R为扩增引物，以乳酸菌DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(3)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，切线目的条带进行纯化；将纯化后的plnE产物进行酶切、重组，并转化至BL21感受态细胞，即得所述乳酸菌素plnE。用基因工程技术体外重组表达乳酸菌素plnE，具有分子量小，人工合成方便且活性高等特点。

所述的plnE上游引物F和plnE下游引物R由上海生工生物工程股份有限公司合成。

所述的酶切将纯化后的plnE产物与质粒pET-32(+)进行双酶切，得到酶切的PCR目的片段和载体片段。

所述的重组是将酶切得到的PCR目的片段和载体片段进行连接反应。

上述乳酸菌素plnE用于杀菌、促进肠道健康以及提高断奶仔猪的免疫力。乳酸菌素plnE不仅具有广谱的抗菌活性，还有一个很重要的功能，就是起到调节黏膜免疫功能的作用，可以提高细胞因子如：MDA5、IFN-α、IFN-β的表达量，这些细胞因子能够杀死肠道中的病微生物，起到调节黏膜免疫功能的作用，从而提高断奶仔猪的免疫力。

所述的菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或巴氏杆菌中的一种或多种。该乳酸菌素plnE具有广谱的抗菌活性，且当同为0.1mg/mL浓度时，plnE的抑菌效果比同类物质更强。