[发明专利]一种单细胞甲基化测序技术及其应用

说明书

本发明公开了一种单细胞甲基化测序技术及其应用。本发明具有如下优点：(1)操作简单，手工操作时间短，不易污染。(2)针对重硫酸盐处理后基因组序列特点，设计预扩增引物。预扩增引物3’端为H碱基。H碱基不与C互补结合，不影响预扩增引物与重亚硫酸盐转化后的序列结合，但可降低随机引物和接头序列结合的几率；(3)具有更高的Mapping率，有效的提高了测序数据的使用率，比目前的scRRBS(平均25％)和scBS(平均10‑30％)左右，提高20％‑30％。本发明对于单细胞DNA甲基化研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种单细胞甲基化测序技术及其应用。

背景技术

近年来的研究显示，DNA甲基化在许多生物过程中都起着关键的调控作用，例如基因表达的调控、转座子的活性、X染色体失活以及基因组印记维持等。基因组DNA甲基化存在组织特异性，且与发育、衰老密切相关，异常的DNA甲基化通常发生在许多疾病甚至癌症细胞的基因组中。目前，在单细胞水平研究全基因组范围内的甲基化已成为研究热点，对高异质性细胞表观遗传信息的发掘有重大意义，大规模单细胞表观遗传学分析，在胚胎发育，复杂疾病如癌症发生的调控机制、细胞异质性，癌症的早期发现和预后效果评估及进行癌症的研究治疗提供了可能。

对于单细胞DNA甲基化，目前主要有2种常用的方法。第一种是单细胞简化甲基化测序技术(scRRBS)，这种方法不但操作复杂，而且由于RRBS技术法的限制，只能够检测到全基因组上5％左右的CpG位点的甲基化信息，且这些位点主要集中在CpG相对密集的区域，如CpG岛、启动子区等，无法得到基因组其他区域的DNA甲基化，限制了scRRBS方法在研究单细胞甲基化方面的应用。第二种是单细胞全基因组甲基化测序技术(Single Cell WholeGenome Bisulfite Sequencing)，可检测单个细胞的全基因组甲基化水平，可检测更多的全基因组上的CpG位点的甲基化信息。但这种方法极其复杂，主要步骤包括细胞裂解、BS转化、带有biotin标记的预扩增引物的预扩增、预扩增一链的磁珠捕获回收、ExoI引物消化、Oligo2引物预扩增以及后续的PCR扩增和indexing。此过程非常耗时和繁复，扩增过程中每个循环都需要新加入Klenow酶，步骤繁复，耗时耗力。反应多次开盖操作，极易造成污染，给后续分析带来极大困难，并造成数据量浪费，测序数据Mapping率低，文献报道的Mapping率仅有10-30％左右，造成大量的数据浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种单细胞甲基化测序技术及其应用。

本发明提供了一种单细胞甲基化测序文库的的构建方法，包括如下步骤：

(1)将单细胞裂解并进行重亚硫酸盐转化；

(2)以步骤(1)处理得到的DNA样本为模板，利用BstDNA聚合酶和引物甲进行第一链的合成；所述引物甲包括测序接头甲和随机引物甲；所述随机引物甲包括5-9个N和1-2个H；所述碱基H位于引物甲的3’末端；

(3)以步骤(2)的产物为模板，利用引物乙进行第二链的合成；所述引物乙包括测序接头乙和随机引物乙；所述随机引物乙包括5-9个N和0-2个H；所述碱基H位于引物乙的3’末端；

(4)对步骤(3)的产物进行PCR扩增，得到测序文库；PCR扩增时向样本引入index标签；

所述测序接头甲和测序接头乙为根据不同测序平台选择对应的测序接头。

所述随机引物甲具体可包括5个N和2个H；

所述随机引物乙具体可包括6个N和1个H。

所述测序平台具体可为illumina测序平台；当测序平台为illumina测序平台是，所述测序接头甲具体可为P5测序接头；所述测序接头乙具体可为P7测序接头。