[发明专利]一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用

说明书

本发明公开了切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用。本发明首次将切刻酶HypaCas9n与PmCDA1和UGI融合构建了碱基编辑系统，发现HypaCas9nPmCDA1UGI与SpCas9nPmCDA1UGI相比，在基本不影响C·T碱基替换效率的情况下，脱靶效率能够降低。

技术领域

本发明涉及一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-CRISPR-associatedprotein 9)技术的出现和发展，已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein–RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(DSB，dsDNAbreak)，而后，生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。一般有两种修复机制，一种是非同源末端连接(NHEJ，non-homologous endjoining)，一种是同源重组(HDR，homology-directed repair)，通常情况下，NHEJ修复占大多数，因此，修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(CBE，cytosine base editor)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶实现直接对单个的C(胞嘧啶，Cytosine)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为T(胸腺嘧啶，Thymine)的碱基编辑效率。PmCDA1(activation-inducedcytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)就是其中使用的一种胞苷脱氨酶。在所测试的PmCDA1编辑器中，SpCas9n(D10A)PmCDA1UGI(尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂，uracil DNA glycosylase inhibitor)碱基编辑系统的平均突变率较高，一是因为UGI可以抑制UDG(尿嘧啶DNA糖化酶，uracil DNAglycosylase)催化清除DNA中U(尿嘧啶，Uracil)，二是因为SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patchBER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。SpCas9n(D10A)连带着PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成U，通过DNA的修复使得U与A(腺嘌呤，Adenine)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。

植物中使用SpCas9进行基因组编辑时具有一定的脱靶效应，SpCas9n(D10A)与PmCDA1融合使用进行碱基编辑，即使用SpCas9n(D10A)PmCDA1UGI碱基编辑系统时可能存在潜在的脱靶风险。虽然植物不同于动物，在后代可以通过遗传分离去除脱靶位点，但是由于一些潜在的脱靶位点可能是未知的，所以，后代中就很难有目的性的去除。因此，降低脱靶效应也是植物中一直以来的技术方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种切刻酶及其在基因组碱基替换中的应用。

本发明首先提供了融合蛋白，由切刻酶、胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1和尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI组成；所述切刻酶如序列表的序列13自N端第1-1423位氨基酸所示。

所述胞嘧啶核苷脱氨酶PmCDA1如序列表的序列13自N端第1521-1728位氨基酸所示。

所述尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂UGI如序列表的序列13自N端第1736-1833位氨基酸所示。

本发明还保护所述融合蛋白的编码基因。